韓艷艷 馬世江 康麗霞 栗延偉 譚軍

摘要：

目的：觀察糖氧剝奪對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響及腺苷的保護(hù)作用。方法：取體外培養(yǎng)第三代或第四代星形膠質(zhì)細(xì)胞，傳代至96孔板或24孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)出突起后，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組（normal control group）、糖氧剝奪組（OGD group）、腺苷預(yù)處理組（ADO group），進(jìn)行糖氧剝奪/復(fù)氧處理。觀察糖氧剝奪8h復(fù)氧糖24h后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性。結(jié)果：糖氧剝奪復(fù)氧糖24h后，正常對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；OGD模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體水腫變圓，細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則變成梭形，突起明顯變短或消失；ADO組細(xì)胞水腫較輕。OGD模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力下降，OD值明顯低于正常對(duì)照組（P<0.01）；ADO組細(xì)胞活力顯著高于OGD模型組，表明ADO能明顯改善細(xì)胞活力（P<0.01）。結(jié)論：糖氧剝奪可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、活性與缺氧缺糖呈對(duì)應(yīng)變化，腺苷能減少糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及細(xì)胞凋亡，提示腺苷對(duì)糖氧剝奪的星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：腺苷；星形膠質(zhì)細(xì)胞；糖氧剝奪

The protection of Adenosine Preconditioning on Oxygen-glucose deprivation injury induced astrocyte cells

【Abstract】

Objective To investigate the effect of oxygen-glucose deprivation and protective effect of adenosine on astrocytes. MethodsAstrocytes were cultured for third or fourth generation in vitro， and then passaged at 96 or 24 well plate. When the astrocytes attaching to the wall and growing with prominences， they were randomly divided into 3 groups， normal control group， oxygen-glucose deprivation （OGD） group and adenosine preconditioning （ADO） group. The cells were taken OGD/reoxygenation treatment. The morphology and activity of astrocyte cells were observed at 8 hours after OGD and 24 hours after reoxygenation. Results At 24 hours after OGD/reoxygenation treatment， the astrocyte cells were with normal morphology in normal control group； the soma of astrocyte cells became edema and round in OGD group， the cell morphology changed to fusiformis from irregular， and prominence obviously became short or disappeared； the edema was lighter in ADO group. Activity of astrocyte cells decreased in OGD group， and OD value was significantly lower than that in normal control group （P<0.01）. Cell activity was higher in ADO group than that in OGD group， which indicated that ADO can obviously improved cell activity （P<0.01）. Conclusions Astrocytes are injured seriously after OGD； morphology and cell activity of astrocytes take change in accordance with oxygen deficit and glucose deprivation. Adenosine can decrease morphological changes and cell apoptosis of astrocyte cells after OGD. we can make conclusion that adenosine has influence on astrocytes after OGD.【Key words】Adenosine； Astrocyte； Oxygen-glucose deprivation

【中圖分類號(hào)】

Q2-09 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）05-0018-02

腦血管疾病是人類三大死亡原因之一，缺血性腦血管病是一類常見病、多發(fā)病，其致殘率與病死率都很高。缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙， 這種恢復(fù)血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷（ischemia- reperfusion injury， IRI） ，這一概念在1970年經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)^[1]，抑制再灌注損傷成為目前治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有研究表明，腺苷及其受體在多種臟器缺血再灌注損傷的保護(hù)方面有重要作用[2、3、4]

。星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte，Ast）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)細(xì)胞，過去Ast僅被視為具有固定神經(jīng)元的功能，對(duì)神經(jīng)元起支持和營養(yǎng)作用。而現(xiàn)在人們逐漸認(rèn)識(shí)到它在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮著很關(guān)鍵的作用。本研究探討腺苷預(yù)處理對(duì)糖氧剝奪損傷Ast的保護(hù)作用，揭示腺苷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制，為腺苷應(yīng)用于臨床治療腦血管疾病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生24小時(shí)內(nèi)的Sprague-Dewley（SD）大鼠，雌雄不限，體重約10-12g。由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器：DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基購于Gibico公司，胰蛋白酶粉、XTT、PMS購于Sigma公司，胎牛血清購于杭州四季青，兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP多克隆抗體購于中杉金橋公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG購于博奧森公司，腺苷（Adension）購于Amresco公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Heraeu公司）、Eclipse E200顯微鏡（日本Nikon公司）、BIO-TEK ELX800 酶標(biāo)儀（美國寶特儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 星型膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)： 參照俞愛青

^[5]的方法行體外SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：取材后利用機(jī)械分離法和差速貼壁法純化培養(yǎng)Ast，接種密度為1×109L-1，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3d半量換液1次。原代細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿瓶底約85%后，即可傳代，傳代細(xì)胞生長(zhǎng)較快，一般5～7d即可再次傳代，取第3代、第4代細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白酶（glial fibrillary acidic protein，GFAP）熒光鑒定（根據(jù)說明書操作）及實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理過程：取第3代或第4代Ast，根據(jù)監(jiān)測(cè)指標(biāo)要求將細(xì)胞傳代時(shí)將其傳至96孔或24孔板內(nèi)，分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（normal control group）、氧糖剝奪模型組（Oxygen glucose deprivation，OGD group）、腺苷預(yù)處理組（ADO group）。實(shí)驗(yàn)正常對(duì)照組不進(jìn)行氧糖剝奪，在氧糖剝奪期及復(fù)氧糖期均更換完全DMEM培養(yǎng)基。OGD組在氧糖剝奪期更換成無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基；ADO組在氧糖剝奪前24h給予含100μmol/L腺苷的完全DMEM培養(yǎng)基，氧糖剝奪時(shí)更換為無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基。

1.3.3 氧糖剝奪/復(fù)氨糖過程：OGD組和ADO組在氧糖剝奪期分別更換為預(yù)熱的無糖DMEM培養(yǎng)基，去培養(yǎng)板蓋，放入自制密閉的溫度保持在（37±0.5）℃的從入口持續(xù)充入缺氧混合氣體（含體積分?jǐn)?shù)為95%N2，5%CO2），出口接入水密封瓶的3升缺氧倉中進(jìn)行缺氧處理。缺氧氣體由缺氧倉頂部進(jìn)入，由底部排出，初以10L/min，6min后缺氧倉內(nèi)O2濃度降至1%，再以1L/min持續(xù)充入缺氧混合氣體，并開始計(jì)時(shí)缺氧8h。8h后取出培養(yǎng)板，OGD組及ADO組均更換為預(yù)熱的復(fù)糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)檢測(cè)以下試驗(yàn)指標(biāo)。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)：觀察氧糖剝奪8h復(fù)氧糖24h后各組Ast形態(tài)學(xué)變化、檢測(cè)細(xì)胞活性變化。

1.3.4.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

1.3.4.2 細(xì)胞活性檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞基本融合后，吸棄培養(yǎng)液，進(jìn)行隨機(jī)分組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，各組氧糖剝奪處理過程如同上述，各孔加入相應(yīng)的培養(yǎng)基100uL，在再復(fù)氧復(fù)糖22h時(shí)，每孔加入預(yù)溫37℃的XTT復(fù)合溶液50μL。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2小時(shí)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，然后將光密度值（OD值）按以下公式計(jì)算：

細(xì)胞存活率=（樣本吸光度-空白組的吸光度）/對(duì)照組的吸光度×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，采用Prism4.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組之間顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析， P<0.05為差異有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察OGD后Ast形態(tài)差異。

糖氧剝奪后，OGD組和ADO組形態(tài)上無明顯差異，均顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞突觸縮短，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞透亮度增加，明顯可見細(xì)胞突觸之間的廣泛聯(lián)系，網(wǎng)狀交織較糖氧剝奪前明顯。復(fù)糖氧24h后可見OGD組細(xì)胞形狀各異、細(xì)胞水腫，胞膜不完整；ADO組水腫相對(duì)較輕，細(xì)胞排列相對(duì)整齊。

2.2 XTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性（對(duì)照組、OGD組、ADO組）： 通過對(duì)XTT比色法的OD值進(jìn)行單因素方差分析制得表1和圖表1。由表1可知，OGD模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞活力下降，OD值明顯低于正常對(duì)照組（P﹤0.01），表明細(xì)胞因受損傷或死亡而導(dǎo)致細(xì)胞活力明顯下降。ADO組細(xì)胞活力顯著高于OGD模型組，表明ADO能明顯改善細(xì)胞活力（P﹤0.01）。

3 討論

腺苷用于缺血再灌注損傷已有很長(zhǎng)時(shí)間，但更多的是用于心肌的缺血再灌注損傷^[6]

。短暫缺血后心肌不僅具有即刻保護(hù)作用，同時(shí)在24～72h 內(nèi)會(huì)出現(xiàn)延遲保護(hù)作用^[7]。腺苷（adenosine， ADO）及其受體參與了心肌缺血預(yù)處理的早期保護(hù)作用，同時(shí)也是延遲保護(hù)的重要介質(zhì)[8、9]。

表1 氧糖剝奪各組XXT法細(xì)胞活性比較（X±S）

目前已知的腺苷受體（adenosine receptor， AR）有4種亞型，即A1受體（A1R）、A2a受體（A2aR）、A2b受體（A2bR）和A3受體（A3R）。 缺血預(yù)處理時(shí)用藥物阻斷A1受體或ATP通道能阻斷缺血耐受的形成。大量的體內(nèi)外研究表明，AlR在腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用原代培養(yǎng)的皮質(zhì)或海馬神經(jīng)元細(xì)胞，在糖-氧剝奪的條件下給予A1R選擇性激動(dòng)劑環(huán)己基處理后，其細(xì)胞損傷明顯減輕，而A1R特異性拮抗劑可加重同一缺氧模型所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。同樣，在腦缺血的動(dòng)物模型中也有類似發(fā)現(xiàn)。這些都提示AlR對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用^[10]。

內(nèi)源性腺苷釋放誘導(dǎo)IPC樣保護(hù)作用，保護(hù)作用分為早期和延遲兩個(gè)時(shí)相，早期保護(hù)在預(yù)處理數(shù)分鐘后出現(xiàn)，持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，可能主要涉及內(nèi)源性活性物質(zhì)；延遲保護(hù)在預(yù)處理后24小時(shí)出現(xiàn)，持續(xù)數(shù)天，與早期保護(hù)不同，與諸多基因表達(dá)的增強(qiáng)或受抑有關(guān)，包括熱休克蛋白（heat derived neurotrophic factor HSP）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor BDNF）細(xì)胞因子、抗氧化酶等^[11].

經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，測(cè)定急性反復(fù)缺血、缺氧小鼠的腦組織內(nèi)腺苷含量，急性缺血、缺氧1次的小鼠，腦組織內(nèi)的腺苷含量高于對(duì)照組（ P < 0、05） ，而反復(fù)急性缺血、缺氧組小鼠腦組織內(nèi)的腺苷含量又高于1次急性缺血、缺氧組^[12]，證明了腦組織缺血、缺氧，特別是反復(fù)缺血、缺氧的刺激，引起動(dòng)物體內(nèi)腺苷含量的升高。吳浩等人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：反復(fù)發(fā)作的短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）會(huì)刺激體內(nèi)腺苷水平升高，并有一定的腦保護(hù)作用，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺血、缺氧的耐受，可能會(huì)改善卒中的癥狀和預(yù)后^[13]。缺糖缺氧可引起海馬神經(jīng)元嚴(yán)重?fù)p傷，神經(jīng)元損傷程度與神經(jīng)元存活率、LDH 滲出含量的改變呈對(duì)應(yīng)變化。腺苷能減少缺糖缺氧后神經(jīng)元的損傷，減少缺糖缺氧后神經(jīng)元凋亡，提示腺苷對(duì)缺糖缺氧海馬神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用^[14]。因此，從理論上講：通過預(yù)先給予星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入腺苷，隨著體外模擬腦缺血模型的建立，激發(fā)腺苷受體的表達(dá)，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血缺氧耐受形成。

該實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)過相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ast對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用^[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，無論從形態(tài)學(xué)變化，還是Ast活性變化，氧糖剝奪對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞可造成嚴(yán)重的損傷，隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷逐漸加重。ADO可減輕氧糖剝奪的星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，具有一定保護(hù)作用。

因此本實(shí)驗(yàn)觀察到的腺苷能減少缺糖缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，減少缺糖缺氧后再恢復(fù)糖和氧供應(yīng)后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，提示腺苷對(duì)體外培養(yǎng)的缺糖缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持上述腺苷通過減輕Ca²⁺超載、氧自由基損傷等引發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、細(xì)胞膜損傷、線粒體損傷及DNA損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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