蛋白質(zhì)腺苷化修飾研究進(jìn)展

胡 陽,丁 明

（中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210009）

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的“執(zhí)行者”,對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域的一大重點(diǎn)。蛋白質(zhì)的功能不僅取決于翻譯完成之后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),也與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾密切相關(guān),例如蛋白質(zhì)的磷酸化、泛素化、糖基化、甲基化、乙酰化、棕櫚酰化等翻譯后修飾機(jī)制已經(jīng)被證明對(duì)于蛋白質(zhì)正常生物學(xué)功能的發(fā)揮至關(guān)重要。蛋白質(zhì)腺苷化修飾是指腺苷化酶以ATP為底物將腺苷一磷酸通過磷酸二脂鍵共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)特定的氨基酸上,從而對(duì)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。最常見且穩(wěn)定的腺苷化修飾發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的側(cè)鏈羥基上[1]。蛋白質(zhì)的腺苷化修飾首先在原核生物中被發(fā)現(xiàn),Stadtman實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中的氮環(huán)境發(fā)生改變時(shí),一個(gè)未知的蛋白會(huì)將腺苷一磷酸連接到谷氨酰胺合成酶上,從而改變谷氨酰胺合成酶的催化活性[2]。但40年之后才出現(xiàn)關(guān)于新的腺苷化修飾的報(bào)道,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)病原微生物副溶血性弧菌的分泌蛋白VopS能夠在真核生物中介導(dǎo)腺苷化修飾[3]。由于真核細(xì)胞中腺苷化修飾的發(fā)現(xiàn),使得該翻譯后修飾機(jī)制再度引起了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。

1 原核生物中的蛋白質(zhì)腺苷化修飾

原核生物中的腺苷化修飾對(duì)原核生物主要起到兩方面作用,首先是維護(hù)原核生物自身的穩(wěn)態(tài)?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)腺苷化酶是來自于大腸桿菌的谷氨酰胺合成酶腺苷轉(zhuǎn)移酶,谷氨酰胺合成酶以谷氨酸和氨離子為底物合成谷氨酰胺,為其他幾種氨基酸和核苷酸的合成提供原料,谷氨酰胺合成酶腺苷轉(zhuǎn)移酶通過腺苷化修飾和去腺苷化修飾調(diào)控谷氨酰胺合成酶的活性,對(duì)菌體中的氮代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義[4-6]。Canhua Lu等將熒光假單胞菌中的FicT在大腸桿菌中表達(dá)之后發(fā)現(xiàn)FicT會(huì)腺苷化修飾DNA促旋酶的亞基GyrB,誘發(fā)SOS反應(yīng),抑制菌體DNA復(fù)制,特異性蛋白AntF是FicT抗毒性蛋白,能夠抑制FicT的腺苷化修飾活性,兩種蛋白組成的毒性-抗毒性分子對(duì)細(xì)菌DNA復(fù)制的調(diào)控具有重要意義[7]。FicT也能夠腺苷化修飾熒光假單胞菌體內(nèi)的拓?fù)洚悩?gòu)酶IV ParE tyr109從而抑制ParE的活性,誘發(fā)SOS反應(yīng)。FicT的上述生物學(xué)功能在假結(jié)核耶爾森菌和金黃色葡萄球菌中得到驗(yàn)證[8-9]。此外,沃爾巴克氏體中的FicT參與的腺苷化修飾過程可能與細(xì)胞生存壓力的調(diào)節(jié)相關(guān)[10]。Sreelatha等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中的假激酶Selo是一種腺苷化酶,能夠腺苷化修飾grxA Tyr13從而通過谷胱甘肽對(duì)大腸桿菌的氧化還原穩(wěn)態(tài)進(jìn)行調(diào)控[11-12]。

原核生物中腺苷化修飾的另一個(gè)生物學(xué)意義是通過對(duì)宿主細(xì)胞相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的劫持來促進(jìn)病原體對(duì)宿主細(xì)胞的入侵。Yarbrough等通過研究表明副溶血性弧菌分泌的腺苷化酶VopS能夠腺苷化修飾宿主細(xì)胞的GTPases家族蛋白R(shí)ac Thr35來抑制宿主細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白聚集,從而破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞骨架,促進(jìn)副溶血性弧菌對(duì)宿主細(xì)胞的入侵[3]。與此同時(shí),副溶血性弧菌分泌的腺苷化酶VopS也被證明能夠通過腺苷化修飾抑制宿主細(xì)胞中的NF-KB、Erk和JNK信號(hào)通路來促進(jìn)副溶血性弧菌對(duì)宿主細(xì)胞的入侵[13]。嗜肺軍團(tuán)菌的效應(yīng)蛋白DrrA也是一種腺苷化酶,宿主細(xì)胞質(zhì)中包含嗜肺軍團(tuán)菌的囊泡會(huì)通過DrrA招募宿主的Rab1b蛋白至囊泡周圍,并對(duì)其進(jìn)行腺苷化修飾,從而影響宿主細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸功能,促進(jìn)嗜肺軍團(tuán)菌對(duì)宿主細(xì)胞的入侵[14-15]。

2 真核生物中的蛋白質(zhì)腺苷化修飾

現(xiàn)階段,真核生物中只有FicD和SELO兩種蛋白質(zhì)被證實(shí)具有腺苷化修飾活性,FicD在尋找亨廷頓蛋白直接相互作用蛋白的酵母雙雜交篩選實(shí)驗(yàn)中首次被發(fā)現(xiàn),因此又被稱為HYPE（Huntingtin yeast interacting protein E）[16]。FicD和其同源蛋白在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性,均由一個(gè)N端跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端I型Fic結(jié)構(gòu)域組成,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[17-19]。

科學(xué)家們對(duì)FicD的研究較為深入,但迄今為止FicD也只有HSPA5、HSP70、eEF1A、HSP40和αSyn 5種下游底物蛋白被發(fā)現(xiàn)。2014年,Ham等在黑腹果蠅的S2細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)dFic對(duì)HSPA5的腺苷化修飾作用[17]。HSPA5定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),是HSP70家族的一員,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）時(shí),HSPA5能夠抑制未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的集聚,從而保護(hù)細(xì)胞,而FicD則通過對(duì)HSPA5特定氨基酸位點(diǎn)的腺苷化修飾影響HSPA5的活性,從而參與到UPR中。現(xiàn)在已知FicD對(duì)HSPA5有3個(gè)特異性的氨基酸腺苷化修飾位點(diǎn),分別是T518、S356和T366,不同位點(diǎn)的修飾對(duì)HSPA5功能的影響也不相同,T518的腺苷化修飾會(huì)抑制HSPA5在UPR中的活性[18,20],而S356和T366的腺苷化修飾則會(huì)增強(qiáng)HSPA5在UPR中的活性[21]。Matthias C.Truttmann等研究表明FicD能夠腺苷化修飾HSP70從而抑制HSP70輔助蛋白正確折疊的功能[22]。與此同時(shí),腺苷化修飾也被報(bào)道存在于帕金森綜合征。Syn是一種突觸蛋白,研究表明Syn蛋白的沉積會(huì)誘發(fā)帕金森綜合征,Anwesha Sanyal等通過體外研究發(fā)現(xiàn)FicD能夠腺苷化修飾Syn,減輕Syn沉積在細(xì)胞中誘發(fā)的相關(guān)表型[23]。與FicD相比,科學(xué)家們對(duì)SELO生物學(xué)功能的了解知之甚少。SELO是哺乳動(dòng)物中25個(gè)含硒蛋白中最大的一個(gè),在多種器官中表達(dá)并定位于線粒體。Sreelatha,A等報(bào)道了人源SELO蛋白晶體結(jié)構(gòu)并揭示了一種蛋白激酶樣折疊,因此他們推測(cè)SELO實(shí)際上是一種可以將AMP而不是磷酸基連接到特定蛋白質(zhì)的Ser,Thr和Tyr殘基上的活性酶,并在體外實(shí)驗(yàn)中證明SELO能夠腺苷化修飾自身和MBP、在細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11]。

3 蛋白質(zhì)腺苷化修飾的檢測(cè)方法

從腺苷化修飾發(fā)現(xiàn)至今,科學(xué)家們已經(jīng)發(fā)展出多種檢測(cè)腺苷化修飾的方法。在研究的早期,32P-α-labeled ATP被添加到腺苷化修飾體外實(shí)驗(yàn)體系中,當(dāng)?shù)孜锉幌佘栈揎棔r(shí)會(huì)被檢測(cè)到放射性[3]?？紤]到進(jìn)行放射性實(shí)驗(yàn)需要專門的材料和處理,Daniel M.Lewallen等開發(fā)出可操作性更強(qiáng)的ATP類似物FL-ATP,FL-ATP的C6被熒光素標(biāo)記,在免疫沉淀以及與質(zhì)譜的聯(lián)用實(shí)驗(yàn)中具有與32P-a-labeled ATP相似的效果[24]。Kathrin Pieles等在巴爾通氏體屬的腺苷化酶BeP2所介導(dǎo)的體外腺苷化修飾實(shí)驗(yàn)中添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的ATP,而后結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)了新的靶蛋白Vimentin,并通過獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證[25]。與此同時(shí),點(diǎn)擊化學(xué)的方法也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)腺苷化修飾的檢測(cè)。Markus Grammel等開發(fā)出帶炔基的N6pATP,該檢測(cè)方法的基本原理是將ATP類似物N6pATP摻入到重組腺苷化酶介導(dǎo)的腺苷化修飾反應(yīng),反應(yīng)完成之后被N6pATP來源的AMP修飾的蛋白質(zhì)在銅催化的條件下與帶有疊氮基團(tuán)的生物素進(jìn)行疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng),進(jìn)而被標(biāo)記上生物素,avidin磁珠富集之后運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)即可找到被腺苷化修飾的蛋白[26]。但該檢測(cè)方法也有一定的局限性,例如由于對(duì)細(xì)胞膜的透過性不高,因此不能用于生理?xiàng)l件下新的腺苷化修飾靶蛋白的發(fā)現(xiàn)。為了解決這一問題,Kielkowski等開發(fā)出新一代ATP類似物pro-N6pA,該類似物中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)被封閉,對(duì)細(xì)胞膜的透過性得到顯著提高,進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被切割成N6pATP,發(fā)揮與之相同的作用,pro-N6pA的開發(fā)使得生理?xiàng)l件下新的腺苷化修飾靶蛋白的發(fā)現(xiàn)成為可能。該團(tuán)隊(duì)還開發(fā)出另外一種ATP類似物pro-N6azA,該類似物的胞內(nèi)衍生物在被修飾到靶蛋白之后進(jìn)行的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)中會(huì)使靶蛋白帶上熒光標(biāo)簽,該熒光標(biāo)簽?zāi)芊€(wěn)定存在至少24小時(shí),使得生理?xiàng)l件下觀察腺苷化修飾的動(dòng)態(tài)變化成為可能[27-28]。腺苷化修飾識(shí)別抗體的發(fā)展也備受關(guān)注。Yi-Heng Hao等以第35位蘇氨酸被腺苷化修飾的Rac1為抗原來誘導(dǎo)產(chǎn)生兔源多克隆抗體,隨后多克隆抗體被用于WB和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體能夠特異性較強(qiáng)地識(shí)別蘇氨酸被腺苷化修飾的蛋白,因此具有被用于識(shí)別未知腺苷化修飾蛋白的潛能[29]。2020年,Dorothea HO¨pfner等開發(fā)出三種特異性識(shí)別腺苷化修飾而較少受肽段骨架影響的多克隆抗體,并在WB、ELISA、IP實(shí)驗(yàn)中對(duì)它們的效果進(jìn)行了驗(yàn)證,雖然在WB實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)交叉識(shí)別MARylation修飾的現(xiàn)象、在IP實(shí)驗(yàn)中不能很好地識(shí)別低豐度腺苷化修飾,但這三種抗體在腺苷化修飾靶蛋白識(shí)別中具有廣闊前景[30]。最近,一些新的腺苷化修飾檢測(cè)方法也相繼被開發(fā)出來。Burak Gulen等人工合成了巰基反應(yīng)核苷酸衍生物TReNDs,該衍生物能夠替代ATP特異且穩(wěn)定地與Fic腺苷化酶活性中心的半胱氨酸側(cè)鏈巰基共價(jià)結(jié)合形成二元復(fù)合物FicTReND,接著捕捉Fic腺苷化酶的特異性底物,他們運(yùn)用IbpA,BepA,FicD和他們已知的底物對(duì)這一方法進(jìn)行了驗(yàn)證,找到已知底物的同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了新的底物,他們稱這種方法為“共沉淀介導(dǎo)的共價(jià)捕捉法”[31]。

4 討論

隨著越來越多的科學(xué)家關(guān)注腺苷化修飾,我們對(duì)腺苷化修飾的了解也在不斷加深。到目前為止,在原核生物中發(fā)現(xiàn)了多種腺苷化酶,并識(shí)別到一些底物。但在真核生物中只發(fā)現(xiàn)了FICD和SELO兩種腺苷化酶且已知的底物較少,特別是暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)SELO的腺苷化修飾底物?？茖W(xué)家們根據(jù)腺苷化酶中催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu),對(duì)已知的腺苷化酶進(jìn)行了詳細(xì)的分類,對(duì)其催化和調(diào)控機(jī)制也進(jìn)行了詳細(xì)的描述,分析了原核生物中的腺苷化修飾對(duì)其自身生理穩(wěn)態(tài)、輔助入侵宿主細(xì)胞具有的重要意義,闡述了真核生物中的腺苷化修飾在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)、神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病中所扮演的角色。與此同時(shí),科學(xué)家們也開發(fā)了多種檢測(cè)方法用于腺苷化修飾的檢測(cè)和腺苷化修飾新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。但總的來說,相對(duì)于其他研究較為成熟的翻譯后修飾,我們對(duì)腺苷化修飾的了解還相當(dāng)匱乏。新的腺苷化酶、已知腺苷化酶的靶蛋白還有待進(jìn)一步發(fā)掘,腺苷化修飾所參與的生物學(xué)過程有待進(jìn)一步研究拓展,腺苷化修飾的檢測(cè)方法還有待進(jìn)一步開發(fā),例如腺苷化修飾蛋白的富集方法的發(fā)現(xiàn)有利于整合提高質(zhì)譜等高通量檢測(cè)方式對(duì)腺苷化修飾蛋白的檢測(cè)能力和可信度?？傊?對(duì)腺苷化修飾相關(guān)問題的回答會(huì)進(jìn)一步加深我們對(duì)生命過程的了解,為相關(guān)疾病的治療提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。