奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)ITS基因測(cè)序及同源性分析

郭書(shū)林 陳 垚 陳信忠 龔艷清 楊俊萍

（1.廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建廈門(mén) 361026；2.山東正大畜禽有限公司）

奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)ITS基因測(cè)序及同源性分析

郭書(shū)林1陳 垚2陳信忠1龔艷清1楊俊萍1

（1.廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建廈門(mén) 361026；2.山東正大畜禽有限公司）

通過(guò)設(shè)計(jì)能擴(kuò)增奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)ITS序列的特異性引物，對(duì)我國(guó)東南沿海8個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖牡蠣中常見(jiàn)的兩種派琴蟲(chóng)相應(yīng)基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，并進(jìn)行同源性分析。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)奧爾森派琴蟲(chóng)ITS序列的同源性超過(guò)99.3％，與國(guó)外分離株的同源性也在98.8％以上；種間同源性分析發(fā)現(xiàn)，奧爾森派琴蟲(chóng)與海水派琴蟲(chóng)和P.honshuensis的同源性較高，分別為94.2％和95.0％，與P.qugwadi的同源性最低，僅62.9％。深圳和三亞分離的北海派琴蟲(chóng)ITS序列有18個(gè)堿基存在差異，其中ITS-1有3個(gè)堿基差異，ITS-2有15個(gè)堿基差異，而5.8S高度保守，沒(méi)有堿基差異；北海派琴蟲(chóng)與其他種類(lèi)之間的差異主要表現(xiàn)在ITS-1和ITS-2區(qū)域；同源性比較發(fā)現(xiàn)，北海派琴蟲(chóng)的同源性在100％-97.9％之間，其中深圳北海派琴蟲(chóng)的同源性較低，為97.9％。種間同源性分析表明，北海派琴蟲(chóng)與奧爾森派琴蟲(chóng)的同源性較高，為89.4％，其次為海水派琴蟲(chóng)和P.honshuensis，與P.qugwadi同源性最低，僅71.9％。

奧爾森派琴蟲(chóng)；北海派琴蟲(chóng)；ITS基因；同源性分析

1 前言

派琴蟲(chóng)(Perkinsosis)最先于1946年在美國(guó)墨西哥灣發(fā)病并大量死亡的美洲牡蠣(Crassostrea virginica)中被發(fā)現(xiàn)，其病原為之后命名的海水派琴蟲(chóng)(Perkinsus marinus)[1]，奧爾森派琴蟲(chóng)(P. olseni)是第2種被發(fā)現(xiàn)的派琴蟲(chóng)。2007年，在中國(guó)東南沿海養(yǎng)殖的近江牡蠣(Crassostrea hongkongensis)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的派琴蟲(chóng)，被命名為北海派琴蟲(chóng)(P. beihaiensis n.sp)，進(jìn)一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)還有其他一些牡蠣和貝類(lèi)也是其易感宿主[2]。至今，國(guó)內(nèi)外較認(rèn)可的派琴蟲(chóng)有7種：海水派琴蟲(chóng)、奧爾森派琴蟲(chóng)、北海派琴蟲(chóng)、P. mediterraneus、P. qugwadi、P. honshuensis、P. chesapeaki，其中又以海水派琴蟲(chóng)、奧爾森派琴蟲(chóng)的流行最為廣泛[3-5]。而我國(guó)發(fā)現(xiàn)的派琴蟲(chóng)則主要為奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)，尚未發(fā)現(xiàn)海水派琴蟲(chóng)[6]。派琴蟲(chóng)呈世界性分布，感染牡蠣、花蛤、縊蟶、鮑魚(yú)、扇貝等多種貝類(lèi)，在許多國(guó)家和地區(qū)造成了嚴(yán)重?fù)p失。1954年以來(lái)，美國(guó)切薩皮克海灣的牡蠣因?yàn)楦腥九汕傧x(chóng)病，年產(chǎn)量由 19000 t下降至40 t[7]。

為了解派琴蟲(chóng)的種類(lèi)及其演化規(guī)律，近年來(lái)許多學(xué)者開(kāi)展了派琴蟲(chóng)種內(nèi)遺傳變異方面的研究，尤其是PCR 技術(shù)被廣泛用于派琴蟲(chóng)的檢測(cè)鑒定以及分子遺傳學(xué)等方面。由于派琴蟲(chóng)核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer, ITS）為非編碼基因區(qū)域，比較保守且進(jìn)化速率較快，因此可以從不太長(zhǎng)的序列中獲得較多的信息[8]。目前在基因庫(kù)（Genbank）中已有多個(gè)派琴蟲(chóng)ITS基因序列，但多數(shù)與奧爾森派琴蟲(chóng)和海水派琴蟲(chóng)有關(guān)，與其他種類(lèi)派琴蟲(chóng)ITS序列有關(guān)的資料則很少，甚至還沒(méi)有完整的ITS基因序列。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)能擴(kuò)增完整ITS序列的引物，對(duì)從我國(guó)東南沿海8個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖牡蠣所分離的奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，并進(jìn)行基因序列同源性分析。這些數(shù)據(jù)可以對(duì)派琴蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)生和遺傳變異提供參考，也可為發(fā)展可靠、準(zhǔn)確和敏感的分子生物學(xué)診斷技術(shù)提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣品

2010-2011年，在福建省莆田市、泉州市、廈門(mén)市和漳州市漳浦縣，廣東省深圳市和廣州市，海南省海口市和三亞市等沿海地區(qū)養(yǎng)殖太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）中培養(yǎng)分離并進(jìn)行鑒定的陽(yáng)性樣本（奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)），保存于-70℃。

2.1.2 試劑

海洋動(dòng)物組織基因組D N A提取試劑盒、2×Tap PCR MasterMix PCR試劑盒、DNA 回收試劑盒、pMG-T克隆試劑盒、DNA Marke等試劑：購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

2.1.3 主要儀器、設(shè)備

低溫恒溫槽：寧波天恒儀器廠(chǎng)；低溫離心機(jī)：美國(guó)Bekman公司；PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；微量核酸測(cè)定儀：德國(guó)拜發(fā)公司產(chǎn)品。

2.2 方法

2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Genbank公布的派琴蟲(chóng)ITS全序列，以AY305326.1、AF509333.1、AF522321.2 、AF150990.1、U07701.1、U07698.1、XM_002784213.1等為模板，通過(guò)DNAMAN比對(duì)，運(yùn)用Primer5.0設(shè)計(jì)多對(duì)能擴(kuò)增多種派琴蟲(chóng)ITS1、ITS2和5.8S全序列的PCR通用引物。通過(guò)試驗(yàn)比較，本研究最終確定的引物為：ITS-F，5'-AACAAGGTTTCCGTAGGT-3'；ITS-R，5'-ATTCAGCGGGTAATCTCA-3'。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，稀釋至20 μM，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 樣品總DNA提取

取待檢牡蠣的鰓、外套膜、消化腺等組織共約100 mg，勻漿后根據(jù)海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取。DNA產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用20μL反應(yīng)體系：PCR擴(kuò)增體系含2×Tap PCR MasterMix 10μL，模板2.0μL，適量上下游引物ITS-F和ITS-R，補(bǔ)充ddH2O至20μL。

PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化：退火溫度優(yōu)化范圍為54℃-61℃，引物濃度從0.1-1μL，循環(huán)次數(shù)設(shè)置25、30、35、40次循環(huán)，確定最佳反應(yīng)條件。

2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析

1.5 ％瓊脂糖凝膠，120V電壓電泳30min。凝膠于凝膠成像儀中觀(guān)察，拍照并記錄結(jié)果。

2.2.5 派琴蟲(chóng)ITS 擴(kuò)增產(chǎn)物回收

將派琴蟲(chóng)ITS 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠按DNA 回收試劑盒（離心柱型）操作說(shuō)明回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2.6 pMG-T載體的連接和轉(zhuǎn)化

按照pMG-T克隆試劑盒操作說(shuō)明連接和轉(zhuǎn)化派琴蟲(chóng)ITS目的PCR片段與pMG-T載體。連接體系為10μL，載體與片段的摩爾比控制在1：3-1：8。轉(zhuǎn)化后挑取白色菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，PCR檢驗(yàn)后對(duì)陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行重組質(zhì)粒提取。

2.2.7 ITS基因序列測(cè)定

提取的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)測(cè)序樣本送3份，結(jié)果相同才被采用。

2.2.8 ITS序列及同源性分析

在Genebank中搜索國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)告的各種派琴蟲(chóng)ITS全基因序列，將其與本項(xiàng)目獲得的派琴蟲(chóng)ITS基因序列用MegAlign軟件和與DNAMAN進(jìn)行同源性分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 ITS序列 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化及擴(kuò)增結(jié)果

通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)條件為：ITS-F、ITS-R各0.5μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性5 min，然后94℃ 1 min、57℃ 1 min、72℃ 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度介于750bp-1000bp之間，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符（見(jiàn)圖1）。

圖1 派琴蟲(chóng)ITS電泳結(jié)果

3.2 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果表明：所設(shè)計(jì)的引物ITS-F和ITS-R能夠有效擴(kuò)增奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)的ITS全序列，測(cè)序結(jié)果與Genbank中奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)相應(yīng)序列比對(duì)的同源性達(dá)98％以上。

3.3 奧爾森派琴蟲(chóng)的ITS序列及同源性分析

通過(guò)對(duì)福建莆田、泉州、廈門(mén)、漳浦、深圳、廣州、海口和三亞等8個(gè)沿海地區(qū)所分離到的奧爾森派琴蟲(chóng)ITS序列進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其ITS序列全長(zhǎng)713 bp，其中ITS-1為183 bp，ITS-2 為371 bp，5.8S為159 bp。經(jīng)統(tǒng)計(jì)上述地區(qū)分離的蟲(chóng)株ITS序列之間合計(jì)有11個(gè)堿基存在差異，其中ITS-1堿基差異有4個(gè)，ITS-2有7個(gè)，而5.8S高度保守沒(méi)有堿基差異；將這些蟲(chóng)株與其他國(guó)家和地區(qū)的派琴蟲(chóng)ITS序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5.8S區(qū)域堿基同樣高度保守，而ITS-1和ITS-2的堿基存在較大差異，說(shuō)明奧爾森派琴蟲(chóng)的ITS的三段序列中5.8S具有高度的保守性。實(shí)際上，奧爾森派琴蟲(chóng)與其他種類(lèi)之間的差異主要表現(xiàn)在ITS-1和ITS-2區(qū)域(見(jiàn)圖2)。

通過(guò)種內(nèi)同源性分析，本次測(cè)序的8個(gè)地區(qū)奧爾森派琴蟲(chóng)ITS序列的同源性在100％-99.3％之間，變異范圍為0.0％-0.7％；莆田和泉州，廈門(mén)和漳浦，?？诤腿齺唺W爾森派琴蟲(chóng)的ITS序列的同源性均達(dá)99.9％以上；相比而言，深圳奧爾森派琴蟲(chóng)的ITS序列與其他地區(qū)的同源性較低，最低為99.3％；與世界其他國(guó)家和地區(qū)所分離的奧爾森派琴蟲(chóng)ITS完整序列比較分析發(fā)現(xiàn)，廈門(mén)和漳浦的蟲(chóng)株與韓國(guó)報(bào)告蟲(chóng)株(AF473840)的同源性達(dá)100％，其他蟲(chóng)株的種內(nèi)同源性也在98.8％以上（見(jiàn)圖3）；這些結(jié)果與Brown 等（2004）報(bào)道的基本一致[9]。種間同源性分析發(fā)現(xiàn)，奧爾森派琴蟲(chóng)與海水派琴蟲(chóng)和P. honshuensis的同源性較高，分別為91.7％-94.2％和93.8％-95.0％，與P. qugwadi的同源性最低，僅62.5％-62.9％（見(jiàn)表1）。

表1 各種派琴蟲(chóng)之間ITS基因的同源性比較(％)

圖3 奧爾森派琴蟲(chóng) ITS基因同源性比較

3.4 北海派琴蟲(chóng)的ITS序列及同源性分析

北海派琴蟲(chóng)的ITS序列全長(zhǎng)738 bp，其中ITS-1 為196 bp，ITS-2為383bp，5.8S為159bp。經(jīng)統(tǒng)計(jì)深圳和三亞的北海派琴蟲(chóng)ITS序列共計(jì)有18個(gè)堿基存在差異，其中ITS-1有3個(gè)堿基差異，ITS-2有15個(gè)堿基差異，而5.8S高度保守，沒(méi)有堿基差異。與其他派琴蟲(chóng)的ITS序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，5.8S的基因同樣高度保守，而ITS-1和ITS-2的堿基存在較大差異，也證明北海派琴蟲(chóng)與其他派琴蟲(chóng)之間的差異主要表現(xiàn)在ITS-1和ITS-2區(qū)域 (見(jiàn)圖2)。

將分離到的深圳和三亞北海派琴蟲(chóng)ITS全序列與Genbank中其他國(guó)家和地區(qū)北海派琴蟲(chóng)ITS序列做種內(nèi)同源性比較發(fā)現(xiàn)，各地分離的北海派琴蟲(chóng)的同源性在100％-97.9％之間，同源性差異在0.0％-2.1％之間（見(jiàn)圖4），而深圳北海派琴蟲(chóng)的同源性較低，最低為97.9％。種間同源性分析表明，北海派琴蟲(chóng)與奧爾森派琴蟲(chóng)的同源性較高，達(dá)87.5％-89.4％，其次為海水派琴蟲(chóng)和P. honshuensis，與P. qugwadi同源性最低，僅71.1％-71.9％（見(jiàn)表1）。

圖 4 北海派琴蟲(chóng)ITS基因同源性比較

4 結(jié)論

（1）本研究利用設(shè)計(jì)的引物成功擴(kuò)增了從我國(guó)東南沿海8個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖牡蠣所分離的奧爾森派琴蟲(chóng)ITS序列。種內(nèi)同源性方面，這些地區(qū)的派琴蟲(chóng)ITS基因序列同源性在100％-99.3％之間，其中深圳奧爾森派琴蟲(chóng)的同源性較低（99.3％），而與其他國(guó)家和地區(qū)相比，同源性也超過(guò)98.8％；種間同源性方面，奧爾森派琴蟲(chóng)與海水派琴蟲(chóng)和P.honshuensis的同源性較高，與P. qugwadi的同源性較低。。

（2）利用該引物也成功擴(kuò)增了在深圳和三亞分離到的北海派琴蟲(chóng)的ITS全基因序列，彌補(bǔ)了目前基因庫(kù)中沒(méi)有北海派琴蟲(chóng)ITS全基因序列的空白。種內(nèi)同源性方面，各地分離的北海派琴蟲(chóng)的同源性在100％-97.9％之間，其中深圳北海派琴蟲(chóng)的同源性較低（97.9％）；種間同源性方面，北海派琴蟲(chóng)與奧爾森派琴蟲(chóng)的同源性較高，達(dá)87.5％-89.4％，其次為海水派琴蟲(chóng)和P. honshuensis，與P. qugwadi同源性最低，僅71.1％-71.9％。

（3）深圳奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)與其他在我國(guó)分離到的奧爾森派琴蟲(chóng)、北海派琴蟲(chóng)相比，其同源性較低，差異性較大，估計(jì)在長(zhǎng)期的地理隔離和不同環(huán)境的影響下，奧爾森派琴蟲(chóng)和北海派琴蟲(chóng)在種內(nèi)或種間形成獨(dú)特的小群遺傳品系。因此，獲得派琴蟲(chóng)特定品系和位點(diǎn)的基因序列數(shù)據(jù)，對(duì)了解和掌握派琴蟲(chóng)的種內(nèi)及種間變異情況具有重要意義。

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Sequencing and Homology Analysis of ITS Gene of P. olseni and P. beihaiensis

Guo Shulin1, Chen Yao2, Chen Xinzhong1, Gong Yanqing1, Yang Junping1
(1.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen, Fujian, 361026; 2.Shandong Zhengda Livestock Co. Ltd.)

By desiging specifi c primers which can amplify ITS sequences of P. olseni and P. beihaiensis, Crassostrea gigas coming form 8 different farming areas were detected, cloned, sequenced and homology analyzed. The results showed that the ITS sequence homology of P. olseni was higher than 99.3％ in different areas of China, and higher than 98.8％ compared with foreign isolates. The interspecific homology analysis showed, P. olseni had a higher homology with P. marinus and P. honshuensis, were 94.2％ and 95.0％ respectively, and had the lowest homology with P. qugwadi, only 62.9％. The ITS sequences of P. beihaiensis isolated from Shenzhen and Sanya had 18 base differences, ITS-1 had 3, ITS-2 had 15, and 5.8s had no differences respectively. The differences of P. beihaiensis and other Perkinsosis were showed in ITS-1 and ITS-2 mainly. P. beihaiensis isolated from Shenzhen had lower homology, only 97.9％, since the range was 100％-97.9％. The interspecifi c homology analysis showed, P. beihaiensis had a higher homology with P. olseni, was 89.4％, followed by P. marinus and P. honshuensis, and had the lowest homology with P. qugwadi, only 71.9％.

P. olseni; P. beihaiensis; ITS Gene; Homology Analysis

S944.4

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J05065）；國(guó)家質(zhì)檢公益專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（201210055）