王水南，彭德良，黃文坤，丁中*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；4.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

旱稻孢囊線蟲(chóng)的快速分子檢測(cè)

王水南1,2，彭德良3,4，黃文坤3,4，丁中1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；4.植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

根據(jù)旱稻孢囊線蟲(chóng)(Heterodera elachista)和常見(jiàn)孢囊線蟲(chóng)的ITS序列比對(duì)分析，設(shè)計(jì)1對(duì)旱稻孢囊線蟲(chóng)特異性引物He–F/He–R，特異性片段長(zhǎng)度為281 bp。運(yùn)用該特異性引物及建立的DNA提取方法和PCR體系，可特異性檢測(cè)旱稻孢囊線蟲(chóng)單條2齡幼蟲(chóng)，可以從混合有1條旱稻孢囊線蟲(chóng)的 0.1 g水稻根組織中特異性檢測(cè)出目的DNA片段。特異性引物He–F/He–R與通用引物D2A/D3B結(jié)合，運(yùn)用一步雙重PCR檢測(cè)方法可快速鑒定單孢囊，也可從初始分離的田間土壤總線蟲(chóng)樣品中直接檢測(cè)出旱稻孢囊線蟲(chóng)。

旱稻孢囊線蟲(chóng)；PCR檢測(cè)；特異性引物

旱稻孢囊線蟲(chóng)(Heterodera elachista)是一種主要侵染水稻的植物寄生線蟲(chóng)，最早于日本櫪木縣的稻田中被發(fā)現(xiàn)[1]。目前該線蟲(chóng)病害在湖南省多個(gè)縣(市)丘陵地帶的水稻田發(fā)生較為普遍[2]。旱稻孢囊線蟲(chóng)一般寄生在寄主根部，其危害癥狀與水肥失調(diào)引起的癥狀極其相似，除吸收寄主的營(yíng)養(yǎng)和對(duì)植物根部造成傷害外，還降低水稻對(duì)水的利用效率，繼而影響寄主的生長(zhǎng)和發(fā)育[3–4]，造成水稻減產(chǎn) 7%～19%[5]。建立簡(jiǎn)單快速檢測(cè)旱稻孢囊線蟲(chóng)的方法有助于旱稻孢囊線蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)與防控。

早期對(duì)線蟲(chóng)主要依靠形態(tài)鑒定，需要大量線蟲(chóng)樣品[6–7]，耗時(shí)費(fèi)力，并可能出現(xiàn)誤診。簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏、對(duì)樣品需求量少的分子生物學(xué)檢測(cè)方法已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

在植物寄生線蟲(chóng)分子檢測(cè)中，基于線蟲(chóng)種間序列差異設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR及其衍生技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)是鑒定線蟲(chóng)種類的重要方法[8]。Buimam 等[9]利用2對(duì)特異性引物及1對(duì)通用引物建立了快速檢測(cè)馬鈴薯白線蟲(chóng)(Globodera pallida)和馬鈴薯金線蟲(chóng)(Globodera rostochiensis)的方法；王瓊等[10]也設(shè)計(jì)出1對(duì)特異性引物，能快速檢測(cè)出香蕉穿孔線蟲(chóng)(Radopholus similis)。

ITS序列在線蟲(chóng)分子診斷中有重要意義，分析線蟲(chóng)的ITS區(qū)域可以快速有效地鑒定農(nóng)業(yè)重要線蟲(chóng)種及線蟲(chóng)近緣種[11–13]。孢囊線蟲(chóng)屬(Heterodera) ITS片段長(zhǎng)度基本相同，一般通過(guò)一種酶或幾種酶酶切就可以將它們區(qū)分開(kāi)[14]。但是酶切方法比較耗時(shí)，并且工作量較大，利用特異性引物PCR檢測(cè)方法不僅操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，而且結(jié)果準(zhǔn)確度高。利用這一技術(shù)已成功建立起快速檢測(cè)甜菜孢囊線蟲(chóng)(H. schachtii)[15–16]、大豆孢囊線蟲(chóng)(H. glycines)[17–18]、禾谷孢囊線蟲(chóng)(H. avenae)[19]的方法。

筆者將旱稻孢囊線蟲(chóng)和常見(jiàn)孢囊線蟲(chóng)的ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)1對(duì)旱稻孢囊線蟲(chóng)的特異性引物He–F/He–R，通過(guò)PCR擴(kuò)增，快速檢測(cè)旱稻孢囊線蟲(chóng)。該方法不僅靈敏度高，特異性強(qiáng)，同時(shí)結(jié)合通用引物D2A/D3B，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，可快速鑒定或檢測(cè)出單孢囊、單條2齡幼蟲(chóng)、田間土壤總線蟲(chóng)及水稻根組織中的線蟲(chóng)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

4個(gè)旱稻孢囊線蟲(chóng)樣品材料(HE–1、HE–2、HE–3和HE–4)分別采集于湖南省長(zhǎng)沙縣、桃江縣、衡東縣和永州市；豌豆孢囊線蟲(chóng)(H.goettingiana)樣品采集于湖南省華容縣；禾谷孢囊線蟲(chóng)、菲利普孢囊線蟲(chóng)(H. Filipjevi)及大豆孢囊線蟲(chóng)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所彭德良研究員惠贈(zèng)。線蟲(chóng)感染水稻根組織采集于長(zhǎng)沙縣干杉鎮(zhèn)。

植物基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)自天根公司，Marker DL2000、6×Loading Buffer、PCR擴(kuò)增試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

1) 孢囊DNA的提取。挑取飽滿的孢囊放入滅菌的PCR管中，加入10 μL ddH2O，7 μL 10×PCR Buffer和3 μL 蛋白酶K溶液(600 μg/mL)，液氮中反復(fù)凍融3次，并用滅菌的玻棒研磨。凍結(jié)后，將PCR管置于–20 ℃冰箱中冷凍至少2 h。將冷凍后的PCR管置于65 ℃溫育90 min，95 ℃加熱10 min使蛋白酶K變性，12 000 r/min離心1 min后取上清，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 2齡幼蟲(chóng)DNA的提取。旱稻孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)采用水稻土壤浸液孵化[20]獲得。挑取分離獲得的2齡幼蟲(chóng)線蟲(chóng)，ddH2O清洗3次，吸取10 μL含單條至15條線蟲(chóng)的ddH2O于滅菌的PCR管中，加入5 μL ddH2O、2 μL 10×PCR Buffer和3 μL 蛋白酶K溶液(600 μg/mL)，液氮中反復(fù)凍融5次。其他操作同1)。

3) 田間多種線蟲(chóng)混合樣品DNA的提取。采集水稻根際土壤500 mL，采用淺盤(pán)法在30 ℃恒溫箱中分離土壤樣品中的線蟲(chóng)。從分離獲得的線蟲(chóng)樣品中隨機(jī)挑取若干條，ddH2O清洗3次，吸取20～30 μL線蟲(chóng)懸浮液于PCR管中，加入10 μL ddH2O、4 μL 10×PCR Buffer、6 μL 蛋白酶K溶液(600 μg/mL)，液氮中冷凍后充分研磨至冰融化，反復(fù)5次。其他操作同1)。

4) 線蟲(chóng)與水稻根組織混合樣品及線蟲(chóng)侵染的水稻根組織DNA的提取。采用植物基因組DNA提取試劑盒提取。

1.2.2 特異性引物的設(shè)計(jì)與檢測(cè)

從NCBI基因庫(kù)中下載旱稻孢囊線蟲(chóng)及常見(jiàn)孢囊線蟲(chóng)的ITS序列，用DNAman軟件進(jìn)行比對(duì)和分析，設(shè)計(jì) 1對(duì)旱稻孢囊線蟲(chóng)特異性引物：He–F (5′–ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA–3′)，He–R(5′–TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT–3′)。引入內(nèi)標(biāo)引物：D2A(5′–ACAAGTACCGTGAGGGA AAGTTG–3′)，D3B(5′–TCGGAAGGAACCAGCTA CTA–3′)，可擴(kuò)增出所有植物線蟲(chóng)的D2D3片段，能直觀反映DNA提取質(zhì)量，有效消除假陰性。

分別提取15、10、5、1條旱稻孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)的DNA，再以2倍濃度梯度將單條旱稻孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)DNA分別稀釋成原DNA濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1 /64、1 /128、1 /256。用特異性引物 He–F/He–R擴(kuò)增不同數(shù)量旱稻孢囊線蟲(chóng)及稀釋后的DNA 模板，以檢驗(yàn)引物He–F/He–R的靈敏度。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer(Mg2+Plus) 5 μL，dNTP Mixtue 4 μL，引物He–F/He–R(10 μmol/L) 2 μL，Taq DNA聚合酶( 5 U/μL)0.4 μL，DNA模板2 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至50 μL。采用無(wú)DNA模板為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，加1 μL 6×Loading Buffer 在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，采用1×TAE 作為電泳緩沖液，120 V下電泳40 min，EB染色后用凝膠成像儀照相觀測(cè)。

1.2.3 特異性引物的擴(kuò)增檢測(cè)

取未感染線蟲(chóng)的水稻根組織0.1 g至2 mL離心管中，分別加入10、5、3、2和1條旱稻孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)。液氮中充分研磨后，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取水稻根組織和旱稻孢囊線蟲(chóng)混合樣品中的DNA，以水稻根DNA模板為對(duì)照，用特異引物He–F/He–R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

分別從湖南省長(zhǎng)沙縣干杉鎮(zhèn)旱稻孢囊線蟲(chóng)危害的3個(gè)水稻田塊以及無(wú)旱稻孢囊線蟲(chóng)危害的3個(gè)水稻田塊采集水稻根組織，剪取500 mg至滅菌的2 mL離心管，液氮中充分研磨后，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取 DNA，用特異性引物He–F/He–R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.4 特異性引物與通用引物結(jié)合的一步雙重PCR擴(kuò)增

分別提取旱稻孢囊線蟲(chóng)、菲利普孢囊線蟲(chóng)、燕麥孢囊線蟲(chóng)、豌豆孢囊線蟲(chóng)及大豆孢囊線蟲(chóng)孢囊的DNA，進(jìn)行特異性引物 He–F/He–R與通用引物D2A/D3B結(jié)合的一步雙重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)引物He–F/He–R的特異性。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixtue 4 μL，引物He–F/ He–R、D2A/D3B( 10 μmol/L)各2 μL，Taq DNA聚合酶( 5 U/μL) 0.4 μL，DNA模板2 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至50 μL。采用無(wú)DNA模板為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件(退火溫度改為56 ℃)及電泳、凝膠成像觀測(cè)等同上。

將6個(gè)無(wú)旱稻孢囊線蟲(chóng)發(fā)生的水稻土樣中分離的線蟲(chóng)混合樣品分成2份，1份加入3條旱稻孢囊線蟲(chóng)，并從旱稻孢囊線蟲(chóng)危害的地塊采集并分離得到4個(gè)線蟲(chóng)混合樣品，提取所有樣品的DNA，進(jìn)行特異性引物He–F/He–R與通用引物D2A/D3B結(jié)合的一步雙重PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)引物He–F/He–R的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物的靈敏度

在特異性引物He–F/He–R擴(kuò)增15、10、5、1條旱稻孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)DNA樣本及8個(gè)稀釋后的DNA樣本(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1 /64、1 /128、1 /256)中，15、10、5、1條旱稻孢囊線蟲(chóng)DNA擴(kuò)增出的281 bp特異性條帶明亮清晰，單條旱稻孢囊線蟲(chóng)DNA量的1/32時(shí)擴(kuò)增出281 bp特異性條帶也比較清晰，單頭旱稻孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)DNA量的1/256時(shí)也能檢測(cè)到特異性條帶，陰性對(duì)照中沒(méi)有條帶(圖1)。說(shuō)明特異性引物He–F/He–R檢測(cè)旱稻孢囊線蟲(chóng)的靈敏度高。

圖1 特異性引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Sensitivity of the specific primers

2.2 特異性引物擴(kuò)增結(jié)果

在 0.1 g水稻根組織中，分別加入10、5、3、2和1條旱稻孢囊線蟲(chóng)，采用特異引物He–F/He–R對(duì)水稻根組織和線蟲(chóng)的混合DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，均得到1條281 bp的特異性條帶，而從水稻根DNA模板中未擴(kuò)增出該條帶(圖2)。

圖 2 旱稻孢囊線蟲(chóng)與水稻根組織混合樣品特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results for mixtures containing H. elachista and rice root tissues using specific primers

進(jìn)一步對(duì)旱稻孢囊線蟲(chóng)侵染的水稻根組織DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增(圖3)，同樣也能擴(kuò)增出281 bp的特異性條帶，而無(wú)旱稻孢囊線蟲(chóng)侵染的水稻根組織DNA沒(méi)有擴(kuò)增出該條帶。表明特異性引物He–F/He–R以及 PCR 體系可以穩(wěn)定地從水稻根組織中檢測(cè)出旱稻孢囊線蟲(chóng)。

圖3 田間旱稻孢囊線蟲(chóng)侵染的水稻根檢測(cè)Fig.3 PCR detection of rice root tissues infected by H. elachista in field

2.3 一步雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果

在旱稻孢囊線蟲(chóng)的一步雙重特異性檢測(cè)中，從4個(gè)縣(市)采集的旱稻孢囊均擴(kuò)增出 2條穩(wěn)定的條帶，其中281 bp條帶是由旱稻孢囊線蟲(chóng)的特異性引物He–F/He–R擴(kuò)增產(chǎn)生，780 bp左右的條帶是由通用引物D2A/D3B擴(kuò)增產(chǎn)生，而菲利普孢囊線蟲(chóng)、燕麥孢囊線蟲(chóng)、豌豆孢囊線蟲(chóng)及大豆孢囊線蟲(chóng)均只有引物D2A/D3B擴(kuò)增產(chǎn)生的780 bp左右的條帶，陰性對(duì)照中沒(méi)有任何條帶(圖 4)。說(shuō)明引物 He–F/ He–R能特異性檢測(cè)旱稻孢囊線蟲(chóng)。

圖 4 旱稻孢囊線蟲(chóng)及其他常見(jiàn)孢囊線蟲(chóng) DNA雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Duplex PCR amplification of DNA from H. elachista and other species of cyst nematode

對(duì)田間土壤總線蟲(chóng)樣品進(jìn)行檢測(cè)，6個(gè)無(wú)旱稻孢囊線蟲(chóng)的線蟲(chóng)樣品只有引物D2A/D3B擴(kuò)增產(chǎn)生的780 bp左右的條帶，加入旱稻孢囊線蟲(chóng)后能擴(kuò)增出2條穩(wěn)定的條帶，同時(shí)采集的旱稻孢囊線蟲(chóng)危害的水稻田土壤總線蟲(chóng)樣品也能擴(kuò)增出2條穩(wěn)定的條帶，陰性對(duì)照中沒(méi)有任何條帶(圖5)。說(shuō)明引物He–F/ He–R特異性高，能用于旱稻孢囊線蟲(chóng)的快速檢測(cè)。

圖5 多種線蟲(chóng)混合DNA雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Duplex PCR amplification from mixed DNA of various nematode samples

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Rapid molecular diagnosis of rice cyst nematode (Heterodera elachista)

WANG Shui-nan1,2，PENG De-liang3,4，HUANG Wen-kun3,4，DING Zhong1,2*
(1.College of Plant Protection , Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Disease and Insect Pests, Changsha 410128, China; 3.Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 4. The State Key Laboratory for Biology of Disease and Insect Pests, Beijing 100193, China)

Based on known ITS sequences of the rice cyst Nematode (Heterodera elachista) and common cyst nematodes, one species-specific primer pair named He?F and He?R was designed for H. Elachista, the expected fragment length of the PCR products using the primers was 281 bp. Using the established DNA extraction method and PCR system with the specific primers, target fragment detected from a single second instar larvae of nematode or an individual H. elachista mixed in 0.1 g rice root tissues. Combined the species-specific primers He-F and He-R with universal primer pairs D2A and D3B, a duplex PCR was established, which detects H. elachista from cyst nematode samples primarily separated from field soil.

Heterodera elachista; PCR detection; specific primers

S432.4+5

A

1007?1032(2014)02?0178?05

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.014

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–11–18

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903040)

王水南(1990—)，女，湖南婁底人，碩士研究生，主要從事植物線蟲(chóng)學(xué)研究，shuinan1228@163.com；*通信作者，dingzx88 @aliyun.com