賀曉玉，羅杰，李英倫

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

發(fā)酵五味子藥渣對斷奶仔豬小腸黏膜的形態(tài)及免疫的影響

賀曉玉，羅杰，李英倫*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

選用 90頭DLY(杜×長×大)斷奶仔豬(28日齡)，隨機(jī)分為5組：空白對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；陽性對照組(0.5% SC組)，飼喂基礎(chǔ)日糧+0.5%北五味子；0.1% FSD組，飼喂基礎(chǔ)日糧+0.1%發(fā)酵五味子藥渣；0.3% FSD 組，飼喂基礎(chǔ)日糧+0.3%發(fā)酵五味子藥渣；0.5% FSD組，飼喂基礎(chǔ)日糧+0.5%發(fā)酵五味子藥渣。每天記錄5組豬的腹瀉情況以及采食量，計(jì)算腹瀉率和料肉比，并于試驗(yàn)第7、14、21天，分別采集空白對照組、0.5% SC組、5% FSD組仔豬的十二指腸、空腸、回腸中段組織以及空腸黏膜，測定腸絨毛高度，隱窩深度，腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量，以及空腸黏膜分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量。結(jié)果表明：0.1%FSD組、0.3%FSD組、0.5%FSD組仔豬的腹瀉率分別比空白對照組低13.87%、30.82%、41.72%；料肉比分別比空白對照組仔豬低1.7%、4.02%、8.6%；與空白對照組相比，0.5% SC和0.5% FSD組仔豬的小腸絨毛較完整；0.5% FSD組仔豬的十二指腸、空腸、回腸絨毛高度顯著增加(P＜0.05)，隱窩深度顯著降低(P＜0.05)，絨毛高度與隱窩深度比值(V/C)提高；0.5% FSD組仔豬腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于空白對照組，腸黏膜SIgA含量極顯著高于空白對照組(P＜0.01)，0.5% FSD組與0.5% SC組各項(xiàng)指標(biāo)的差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

斷奶仔豬；發(fā)酵；五味子藥渣；蛹蟲草菌；黏膜上皮形態(tài)；黏膜免疫

目前，中藥提取工藝比較單一，導(dǎo)致藥渣中還殘留許多藥用活性成分。據(jù)報道，中成藥制藥過程中有效成分的提取率一般為30%～70%，部分有效成分仍殘留在藥渣中[1]。研究[2–4]表明，中藥渣可作為動物飼料添加劑，提高動物免疫力，促進(jìn)動物生長。但是，多數(shù)研究停留在將中藥渣直接添加到飼料中。本試驗(yàn)采用藥用真菌雙向性固體發(fā)酵工程[5–7]，將五味子藥渣用蛹蟲草菌(Cordyceps militaris)發(fā)酵，并將發(fā)酵產(chǎn)物添加到斷奶仔豬日糧中，檢測飼喂發(fā)酵五味子藥渣后仔豬小腸黏膜上皮形態(tài)以及黏膜免疫系統(tǒng)的變化，旨在為發(fā)酵五味子藥渣的臨床應(yīng)用及中藥渣的回收再利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵五味子藥渣的制備

將雅安三九藥業(yè)提供的五味子藥渣烘干(50 ℃)，粉碎過850 μm孔徑篩。然后，稱取40 g置于蟲草發(fā)酵瓶中，加入70 mL蒸餾水，高壓蒸汽滅菌后，接入9 mL蛹蟲草菌菌液(山東省東方蟲草科技園產(chǎn)品)，于25 ℃下避光培養(yǎng)15 d 后，將整個培養(yǎng)基質(zhì)50 ℃烘干，粉碎，制成發(fā)酵五味子藥渣，備用。

1.2 動物分組及飼養(yǎng)管理

選用90頭體重為(7.13±0.22) kg 的28日齡“杜× 長×大”三元雜交斷奶仔豬，按性別、體重和窩源基本一致原則隨機(jī)分為5組，每組3個重復(fù)。各組分別飼喂基礎(chǔ)日糧(空白對照組)、基礎(chǔ)日糧+0.5%北五味子(0.5% SC組)、基礎(chǔ)日糧+0.1%發(fā)酵五味子藥渣(0.1% FSD組)、基礎(chǔ)日糧+0.3%發(fā)酵五味子藥渣(0.3% FSD組)、基礎(chǔ)日糧+0.5%發(fā)酵五味子藥渣(0.5% FSD組)。試驗(yàn)期為21 d。基礎(chǔ)日糧參照NRC(1998)[8]豬的營養(yǎng)需要以及試驗(yàn)豬場的飼糧配方，配成全價粉狀料。試驗(yàn)在同一棟雙列封閉式豬舍內(nèi)進(jìn)行。自由采食，自由飲水。免疫消毒程序按豬場常規(guī)方法進(jìn)行。每天9:00～19:00觀察仔豬的排糞情況，統(tǒng)計(jì)仔豬腹瀉頭數(shù)。在試驗(yàn)初期和結(jié)束時對各組仔豬稱重，記錄各組飼料消耗量。

1.3 樣品采集與處理

于試驗(yàn)第7、14、21天，分別從空白對照組、0.5% SC 組、0.5% FSD組中隨機(jī)選取3頭仔豬，經(jīng)前腔靜脈放血處死，剖解后取十二指腸、空腸、回腸中段3～5 cm腸管，迅速置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于制作組織切片，測量絨毛高度、隱窩深度，統(tǒng)計(jì)上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量。同時，取空腸起始端至回盲括約肌腸管，縱向剪開腸管，暴露黏膜面，用磷酸緩沖液(PBS，pH7.2)流動沖洗后平鋪于濾紙上，用清潔載玻片輕輕刮取腸黏膜[9]，置于EP管中，–20 ℃保存，用于檢測SIgA含量。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 腹瀉率及料肉比

計(jì)算腹瀉率和料肉比(FCR)。腹瀉率=腹瀉頭數(shù)/仔豬總頭數(shù)×100%；FCR=消耗飼料總量/增重總量。

1.4.2 腸道黏膜上皮形態(tài)

腸道組織固定48 h后，經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋處理后，連續(xù)切片(5 μm)，以蘇木精–伊紅(HE)和AB–PAS染色法[10]對切片進(jìn)行染色，封片。用顯微鏡觀察腸黏膜結(jié)構(gòu)，并以Motic Med 6.0圖像軟件分析。在HE染色切片上，選擇5個典型視野(絨毛完整，走向平直)測量每個視野中最長絨毛處的絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)數(shù)每200個柱狀上皮細(xì)胞間的淋巴細(xì)胞。在AB–PAS染色切片上，計(jì)數(shù)每100個柱狀上皮細(xì)胞間的杯狀細(xì)胞[11–12]。

1.4.3 黏膜SIgA含量

取1 g腸黏膜樣品置于9 mL蒸餾水中，用微型攪拌器搗碎，勻漿5 min。以3 000 r/min離心20 min，取上清液，用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定SIgA含量。操作步驟按豬分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA Kit(成都康迪生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵五味子藥渣對仔豬腹瀉率及料肉比的影響

從表1可以看出，0.1% FSD，0.3% FSD組仔豬與空白對照組相比，腹瀉率和料肉比均有降低趨勢，但差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0.5% FSD組仔豬腹瀉率和料肉比與空白對照組相比，均極顯著降低(P＜0.01)，說明添加一定量發(fā)酵五味子藥渣能夠防治仔豬腹瀉，改善腸道消化吸收功能，提高飼料利用率，且添加0.5%時效果最佳。0.5% FSD組與0.5% SC組仔豬的腹瀉率及料肉比的差異不顯著，說明發(fā)酵五味子藥渣防治斷奶仔豬腹瀉、促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化的效果與五味子相當(dāng)。

表1 斷奶仔豬的腹瀉率及料肉比Table 1 Diarrhea rates and FCR of weaned piglets

2.2 發(fā)酵五味子藥渣對仔豬腸道黏膜形態(tài)的影響

通過腸道組織切片觀察，空白對照組仔豬絨毛萎縮、脫落、排列紊亂，且有折斷、扭曲與變形，而0.5% FSD組及0.5% SC組絨毛較完整(圖1～3)。試驗(yàn)第7、14、21天各組仔豬小腸絨毛高度、隱窩深度及V/C值的比較見圖4～6。從圖4～6中可以看出，

0.5 % FSD組仔豬十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度較空白對照組高，隱窩深度較空白對照組低，絨毛高度和隱窩深度比值(V/C)顯著高于空白對照組(P

＜0.05)。0.5% FSD組仔豬腸道的絨毛高度、隱窩深度與0.5% SC組的相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組仔豬十二指腸絨毛形態(tài)Fig.1 Villus morphology of duodenum from piglelts of different groups

圖2 各組仔豬回腸絨毛形態(tài)Fig.2 Villus morphology of jejunum from piglelts of different groups

圖3 各組仔豬空腸絨毛形態(tài)Fig.3 Villus morphology of ileum from piglelts of different groups

圖4 不同試驗(yàn)期仔豬小腸的絨毛高度Fig. 4 Intestinal villus height of weaned piglets from each group at different sampling times

圖5 不同試驗(yàn)期仔豬小腸的隱窩深度Fig.5 Intestinal crypt depth of weaned piglets from each group at different sampling times

圖6 不同試驗(yàn)期仔豬小腸的V/C值Fig.6 V/C value of weaned piglets from each group at different sampling times

2.3 發(fā)酵五味子藥渣對上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

圖7 腸道上皮內(nèi)的杯狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞Fig.7 Intestinal epithelial goblet cells and intestinal intraepithelial lymphocytes of weaned piglets

表2 斷奶仔豬腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞的檢測結(jié)果Table 2 Effects of fermented dregs of S. chinensis on the number of intestinal intraepithelial goblet cells and intraepithelial lymphocytes of weaned piglets

各組仔豬小腸黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞形態(tài)相似(圖7)，其計(jì)數(shù)結(jié)果見表2。0.5% FSD組第7、14、21天仔豬的十二指腸以及第7、14天的空腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組(P＜0.05)。 0.5% FSD組第7、14、21天的空腸以及第21天的回腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)均顯著高于空白對照組(P＜0.05)。0.5% FSD組與0.5% SC組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，日糧中添加0.5%的發(fā)酵五味子藥渣可以增加斷奶仔豬腸道黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的數(shù)量。

2.4 發(fā)酵五味子藥渣對斷奶仔豬腸黏膜中 SIgA含量的影響

各組仔豬小腸黏膜SIgA含量檢測結(jié)果見表3。隨著試驗(yàn)時間的推移，各組仔豬黏膜SIgA含量均逐漸升高。在試驗(yàn)期內(nèi)，0.5% FSD組和0.5% SC組仔豬小腸黏膜的SIgA含量顯著或極顯著高于空白對照組(P＜0.05或P＜0.01)，且0.5% FSD組高于0.5% SC組，在第21天時兩組差異顯著(P＜0.05)，表明在斷奶仔豬日糧中添加發(fā)酵五味子藥渣可以增加腸道黏膜中SIgA含量，且作用效果優(yōu)于五味子。

表3 斷奶仔豬腸黏膜的SIgA 含量Table 3 Effects of fermentaed dregs of S. chinensis on SIgA content in intestinal mucosa of weaned piglets

3 結(jié)論與討論

小腸的絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度與隱窩深度比值(V/C)是衡量小腸消化吸收的重要指標(biāo)。腸道上皮結(jié)構(gòu)的完整性是構(gòu)成腸道黏膜免疫屏障的基礎(chǔ)。小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞以及黏膜SIgA是腸道黏膜免疫系統(tǒng)中的重要組成部分[13–16]。本研究用蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣，將其添加到仔豬日糧中，發(fā)現(xiàn)飼喂添加了0.5%發(fā)酵五味子藥渣的仔豬，其小腸絨毛高度提高，隱窩深度降低，V/C值提高，腸道上皮結(jié)構(gòu)完整，腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)量以及黏膜SIgA的含量均增加。表明發(fā)酵五味子藥渣能促進(jìn)小腸消化吸收功能，提高飼料報酬和仔豬的免疫功能。

五味子屬于收澀藥，具有止瀉、提高機(jī)體免疫力、保肝、抗氧化作用[17]。蛹蟲草菌菌絲體具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用[18–19]。本試驗(yàn)所用發(fā)酵五味子藥渣是將五味子藥渣用作蛹蟲草菌的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)一段時間后將整個發(fā)酵基質(zhì)烘干、粉碎制成。在這一過程中，蛹蟲草菌利用自身產(chǎn)生的各種酶，如纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等分解和利用五味子藥渣中的營養(yǎng)成分生長成菌絲體，同時在酶的分解作用下，殘留在五味子藥渣中的有效成分溶出增加[5]。前期測定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵五味子產(chǎn)物中蟲草素含量高達(dá)0.51%，多糖含量達(dá)2.87%(數(shù)據(jù)待發(fā)表)，因此，試驗(yàn)仔豬消化、免疫能力的提高既有發(fā)酵基質(zhì)中五味子有效成分的作用，又有蛹蟲草菌菌絲體的有效成分的作用。

斷奶應(yīng)激對仔豬腸道屏障的破壞，造成仔豬腸道免疫功能受損[20]，進(jìn)而造成仔豬食欲不振、消化不良、增重緩慢、腹瀉等現(xiàn)象。斷奶應(yīng)激對仔豬腸黏膜形態(tài)有很大影響，包括絨毛萎縮，高度下降，隱窩加深等[21–23]，因此，蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣有望用于改善仔豬的斷奶應(yīng)激。

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Effects of fermented dregs of Schisandra chinensis on intestinal morphology and mucosal immunity of weaned piglets

HE Xiao-yu, LUO Jie, LI Ying-lun*
(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China)

Ninety 28-day-old weaned piglets were divided randomly into 5 groups. In blank control group, piglets were fed with basal diet; in positive control group (0.5% SC group), piglets were fed with basal diet supplemented with 0.5% Schisandra chinensis (S. chinensis); in 0.1%, 0.3% and 0.5% FSD groups, piglets were fed with basal diet respectively supplemented with 0.1%, 0.3%, 0.5% fermentated dregs of Schisandra chinensis. Diarrhea and feed intake data of piglets from the 5 groups were recorded for calculation of diarrhea rate and feed conversion ratio. Tissues from the middle part of duodenum, jejunum and ileum and jejunum mucosal of piglets from the control group, 0.5% SC group and 0.5% FSD group were collected 7, 14 and 21 days post-experiment for determination of the villus height, crypt depth, the number of intestinal epithelium cells and goblet cells and content of SIgA. The results showed that the diarrhea rate of 0.1% FSD group, 0.3% FSD group and 0.5% FSD group were respectively 13.87%, 30.82% and 41.72% lower than that of the control group; the FCR of 0.1% FSD group, 0.3% FSD group and 0.5% FSD group were respectively 1.7%, 4.02%, 8.6% lower than that of the control group. Compared to the control group, intestine villus of piglets from 0.5% SC group and 0.5% FSD group was complete；the villus height of duodenum, jejunum and ileum in piglets from 0.5% FSD group increased (P＜0.05) while the crypt depth decreased (P＜0.05), and the ratio of villus height to crypt depth was increased. The number of goblet cells and lymphocyte cells were higher, and the SIgA levels were extremely higher (P＜0.01) in

intestine of piglets from 0.5% FSD group compared with the control group. And there had no significant difference in indexes mentioned above between 0.5% SC group and 0.5% FSD group.

weaned piglets; fermentation; Schisandra chinensis dregs; Cordyceps militaris; morphology of musocal epithelium; mucosal immunity

S816.7；S853.72

A

1007?1032(2014)02?0196?06

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.018

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–11–23

四川省科技支撐計(jì)劃(2013NZ0019)

賀曉玉(1988—)，女，四川簡陽人，從事獸醫(yī)藥理及毒理研究，hexy881001@163.com；*通信作者，liyinglun01@163.com