五味子藥渣發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)仔豬血液生理指標(biāo)和免疫功能的影響

羅杰，賀曉玉，黃朝翔，牟超，李英倫

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

五味子藥渣發(fā)酵菌質(zhì)對(duì)仔豬血液生理指標(biāo)和免疫功能的影響

羅杰，賀曉玉，黃朝翔，牟超，李英倫*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014)

選擇28日齡“杜×長×大”斷奶仔豬90頭，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧；低劑量組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.1%蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)；高劑量組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.2%蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭。飼喂14 d后，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1頭仔豬，前腔靜脈采血，測定血液生理成分，外周血淋巴細(xì)胞亞群和增殖活性，以及血清中白細(xì)胞介素–2(IL–2)和γ–干擾素(IFN–γ)的含量。結(jié)果：與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組仔豬的白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)和血小板分布寬度(PDWcv)均無顯著性差異(P＜0.05)；高劑量組紅細(xì)胞(RBC)和血紅蛋白(HGB)含量顯著增加(P＜0.05)；低劑量和高劑量組CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比值、淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)均極顯著增加(P＜0.01)；高劑量組血清IFN–γ含量顯著提高(P＜0.05 或 P＜0.01)，各組豬的血清IL–2含量的差異均不顯著(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，五味子藥渣發(fā)酵菌質(zhì)能優(yōu)化仔豬血液的生理指標(biāo)，提高仔豬的免疫功能。

仔豬；五味子藥渣；發(fā)酵；蛹蟲草菌；血液指標(biāo)；免疫活性

Key words:weaned piglets; residue of Schisandra chinensis extract; fermentation; Cordyceps militaris; hematologic parameters

隨著中國中醫(yī)藥事業(yè)的蓬勃發(fā)展，提取中藥后產(chǎn)生的藥渣越來越多。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國每年的藥渣排放量已超過3 000萬噸[1]。制備生脈注射液過程中產(chǎn)生的五味子藥渣就是其中之一。這些藥渣或被廢棄，造成環(huán)境污染和中藥資源浪費(fèi)；或經(jīng)粗加工后添加于動(dòng)物日糧中。但由于可利用活性物質(zhì)少、制備工藝粗糙，導(dǎo)致生物學(xué)效應(yīng)較低。中藥渣經(jīng)有益微生物發(fā)酵和受微生物酶的影響，其自身成分得到改變，產(chǎn)生新的有效物質(zhì)和性味功能，從而提高藥效和擴(kuò)大適應(yīng)癥[2–3]。已有研究表明，川芎辛夷湯藥渣[4]、木薯渣[5]和海帶廢渣[6]的發(fā)酵物具有增強(qiáng)免疫、促生長和抗氧化等功效。近年來，蛹蟲草菌(Cordyceps militaris)發(fā)酵工藝日趨成熟，發(fā)酵產(chǎn)物具有廣泛的藥理活性，但未見蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以斷奶仔豬為試驗(yàn)對(duì)象，在日糧中添加不同水平的蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)，研究其對(duì)仔豬血液生理指標(biāo)和免疫功能的影響，旨在為發(fā)酵菌質(zhì)的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試動(dòng)物及飼糧

選擇胎次一致、品種相同的“杜×長×大”28日齡斷奶仔豬90頭，平均體重(7.4±0.3) kg?；A(chǔ)飼糧參照美國NRC (1998)[7]豬的營養(yǎng)需要設(shè)計(jì)，配制成全價(jià)粉狀料，其組成見表 1。營養(yǎng)水平包括消化能(14.48 MJ/kg)、粗蛋白質(zhì)(20.50%)、鈣(0.85%)、總磷(0.67%)、賴氨酸(0.55%)、蛋氨酸(1.55%)、色氨酸(0.27%)、蘇氨酸(1.01%)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Constituent of the base diet (dry level) %

1.1.2 菌種與藥渣

蛹蟲草菌購自中國科學(xué)院微生物研究所；五味子藥渣為生脈注射液中北五味子提取后殘?jiān)?雅安三九藥業(yè)惠贈(zèng))。

1.1.3 儀器與試劑

KDC–2046低速冷凍離心機(jī)(中佳公司)；Thermo Forma 311 型CO2培養(yǎng)箱(Thermo Labsystems公司)；Bio–rad 680酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio–Rad公司)；ECLIPSE TS100–F 型倒置顯微鏡(Nikon 公司)；BD FACSCalibur 1010流式細(xì)胞儀(BD公司)。

刀豆蛋白 A(ConA)購自 Signa公司；Cell counting kit–8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；胎牛血清購自 Gibco公司；RPMI–1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司；其他試劑為國產(chǎn)，分析純。

1.2 方 法

1.2.1 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)的制備

將蛹蟲草菌接種于土豆培養(yǎng)基(馬鈴薯 200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L)上復(fù)壯6 d；在裝有200 mL菌種營養(yǎng)液(葡萄糖20 g，酵母膏5 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂l g，維生素B150 mg，水1 L)的500 mL三角瓶中無菌接入2個(gè)蛹蟲草菌斜面菌塊，120 r/min搖床培養(yǎng)6 d，形成均勻菌球；將五味子藥渣與水以1∶1.5的質(zhì)量比混合，在發(fā)酵瓶中攪拌均勻，經(jīng)121 ℃滅菌30 min后降至室溫，按干藥渣的15%無菌接入菌種，靜置于生化培養(yǎng)箱中22 ℃發(fā)酵15 d。發(fā)酵結(jié)束后將菌質(zhì)在40～50 ℃烘箱中干燥，粉碎過250 μm孔徑篩。

1.2.2 試驗(yàn)分組與飼養(yǎng)管理

將90頭試驗(yàn)豬隨機(jī)分為3組：對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧；低劑量組在基礎(chǔ)日糧中添加0.1%蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)；高劑量組在基礎(chǔ)日糧中添加0.2%蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)進(jìn)行飼喂。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬，分圈飼養(yǎng)。按豬場常規(guī)飼養(yǎng)管理程序飼養(yǎng)。預(yù)試期3 d，正試期14 d。飼喂方法采用群飼，每日均定時(shí)(7∶30、12∶00、17∶00)喂料3次，自由飲水，保持圈內(nèi)清潔。

1.2.3 血液的采集

于試驗(yàn)14 d時(shí)，早上喂料前從每個(gè)重復(fù)中選1頭仔豬，前腔靜脈采血10 mL，注入EDTA–Na抗凝管中，即為抗凝血；采血2 mL不加抗凝分離血清，–20 ℃冷凍保存，備用。

1.2.4 仔豬血液指標(biāo)的測定

采用SysncxK–1000 血液細(xì)胞自動(dòng)分析儀測定白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞(LYM)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)和血小板分布寬度(PDWcv)。

1.2.5 仔豬外周血淋巴細(xì)胞亞群分類的測定

取2 mL抗凝血加入2 mL淋巴細(xì)胞分離液，800×g 離心 20 min，小心收集中間層淋巴細(xì)胞，RPMI–1640液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106個(gè)/mL，從中取200 μL，以小鼠抗豬 CD3、CD4、CD8單克隆抗體(BIOTECT公司)染色后，以流式細(xì)胞儀檢測CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的百分比，并計(jì)算 CD3+CD4+T細(xì)胞與CD3+CD8+T細(xì)胞的比值。

1.2.6 仔豬外周血淋巴細(xì)胞增殖功能測定

按1.2.5的方法獲取淋巴細(xì)胞，最后以RPMI–1640培養(yǎng)液(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，小牛血清10%)，將細(xì)胞稀釋成2.5×106個(gè)/mL，制成單細(xì)胞懸液(臺(tái)盼藍(lán)檢測細(xì)胞存活率大于 95%)。取單細(xì)胞懸液90 μL加入96孔板中，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，并加入50 μg/mL的Con A溶液10 μL，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(不加Con A)；置37 ℃，5% CO2箱中培養(yǎng)44 h后加入10 μL CCK–8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在Bio–Rad 酶聯(lián)免疫檢測儀上以A630 nm為參比波長，測定樣品的吸光值(A450 nm)，并計(jì)算增殖指數(shù)SI (stimulation index，SI)。SI=試驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值。

1.2.7 仔豬血清IL–2、IFN–γ的測定

用IL–2、IFN–γ檢測試劑盒(武漢基因美公司)測定血清中IL–2、IFN–γ的含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用方差分析(one–way ANOVA)法進(jìn)行多組間顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)對(duì)仔豬血液生理指標(biāo)的影響

由表2可知，斷奶仔豬添加蛹蟲草發(fā)酵五味子藥渣后，低劑量組WBC、LYM、RBC、HGB、HGB、MCHC、PLT、MPV、PDWcv與對(duì)照組的差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量組RBC、HGB均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；WBC、LYM、HCHC、PLT、MPV高于對(duì)照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PDWcv值低于空白對(duì)照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 斷奶仔豬血液生理指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Test results for blood physiological index of weaned pigs

2.2 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)對(duì)仔豬外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞流式檢測結(jié)果見表3。與對(duì)照相比，在日糧中添加蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣對(duì)仔豬外周血淋巴細(xì)胞亞群有正面影響。低劑量組 CD3+T細(xì)胞百分率與對(duì)照組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞的百分率均低于對(duì)照組(P＜0.01)，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值高于對(duì)照組(P＜0.01)；高劑量組CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞的百分率高于對(duì)照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CD3+CD8+T細(xì)胞的百分率低于對(duì)照組(P＜0.01)，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值高于對(duì)照組(P＜0.01)。

表3 斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞的流式檢測結(jié)果Table 3 Results of flow cytometry for lymphocytes in peripheral blood of weaned pigs

2.3 蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)對(duì)仔豬外周血T淋巴細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞因子的影響

從表4可看出，蛹蟲草發(fā)酵五味子藥渣菌質(zhì)組能提高仔豬血液T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，低劑量組和高劑量組增值指數(shù)比對(duì)照組分別提高 5.36% (P＜0.01)和 21.43%(P＜0.01)。與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組能提高仔豬血清 IL–2的含量，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與對(duì)照組相比，低劑量組和高劑量組血清INF–γ的含量增加，分別提高3.93%(P＜0.05)和5.71%(P＜0.01)。可見，血清細(xì)胞因子的分泌量與淋巴細(xì)胞活性呈正相關(guān)。

表4 斷奶仔豬外周血T淋巴細(xì)胞增值指數(shù)和IL–2、IFN–γ含量Table 4 T lymphocyte amplification index and contents of IL–2 and IFN–γ in blood of weaned pigs

3 討 論

在生脈注射液制備過程中，主要提取了五味子脂溶性的萜類、揮發(fā)油、五味子素，以及水溶性的多糖、有機(jī)酸和維生素等。在提取后的五味子藥渣中，有些殘留物質(zhì)仍具有良好的生物活性。微生物發(fā)酵藥渣有著獨(dú)特的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制[2,8]，蛹蟲草菌可利用五味子藥渣中的纖維、糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分進(jìn)行生長，并破壞細(xì)胞壁使五味子木脂素等殘留的有效成分溶出和富集；在生長過程中產(chǎn)生初生或次生代謝產(chǎn)物，并有可能與五味子藥渣中的一些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，或直接對(duì)五味子藥渣中的某些成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化而形成新的化合物等。秦嶺等[9]以生脈飲藥渣為原料，多菌種混合發(fā)酵后產(chǎn)物蛋白增加86.96%，粗纖維降低20.09%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧中添加 0.2%的五味子藥渣發(fā)酵菌質(zhì)，能提高仔豬血液中RBC、HGB、WBC、LYM、 HCHC、PLT和MPV，提示發(fā)酵菌質(zhì)有可能改善免疫應(yīng)激下紅細(xì)胞向機(jī)體運(yùn)送氧氣的能力。試驗(yàn)結(jié)果還表明，飼喂五味子藥渣發(fā)酵菌質(zhì)的仔豬的外周血CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值提高，ConA介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)，且血清中IL–2、IFN–γ含量增加，這與血液常規(guī)生理指標(biāo)顯示免疫增強(qiáng)的結(jié)果相同。本試驗(yàn)結(jié)果不同于張瑞等[10]報(bào)道的五味子殘?jiān)鼘?duì)白羽野鴨生產(chǎn)性能和免疫功能無顯著影響的結(jié)論，這可能是由于五味子藥渣經(jīng)過蛹蟲草菌發(fā)酵后的菌質(zhì)生物活性比原藥渣顯著提高所致。

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Effect of fermented Schisandra chinensis residue on blood physiology parameters and immunomodulation of weaned piglets

LUO Jie, HE Xiao-yu, HUANG Chao-xiang, MOU Chao, LI Ying-lun*
(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China)

Ninety crossbred weaned piglets “Duroc × Landrace × Yorkshire” aged 28 days were randomly allocated into 3 groups (3 replicates for each group and 10 pigs for each replicate). Pigs in the control group were fed with basic diet, in low-dose group with basic diet plus 0.1% Cordyceps militaris fermented Schisandra chinensis residue and in high-dose group with basic diet plus 0.2% Cordyceps militaris fermented Schisandra chinensis residue for 14 days. Then one pig from each replicate was selected for blood collection by anterior vena cava venipuncture for analysis of the routine blood parameters, peripheral T lymphocyte subgroups and their proliferative activities, as well as the IL–2, IFN–γ contents. Results showed there was no difference in white blood cells (WBC), lymphocyte (LYM), mean erythrocyte haemoglobin concentration (MCHC), platelet count (PLT), mean platelet volume (MPV) and platelet distribution width (PDWcv) (P＞0.05) between the control group and the low- and high-dose groups. Compared to the control, the contents of RBC and HGB in high-dose group were significantly increased (P＜0.05), the CD4+/CD8+ratio and proliferation function of peripheral blood T cell in low- and high-dose groups were extremely significantly increased (P＜0.01), the serum IFN-γ contents in high-dose group were also increased (P＜0.05 or P＜0.01), but there was no significant difference in serum IL-2 contents of piglets among groups (P＞0.05). It was concluded that dietary supplied with Cordyceps militaris fermented Schisandra chinensis residue improves the immunologic function and optimizes blood physiology parameters of piglets.

S816.7；S852.72

A

1007?1032(2014)02?0188?04

10.13331/j.cnki.jhau.2014.02.016

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2013–10–14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272599)

羅杰(1987—)，男，四川丹棱人，碩士研究生，主要從事中獸藥與中獸醫(yī)研究，luojie1588@sina.cn；*通信作者，liyinglun01@163.com