章安源 馮 濤 陳 玲 李淑花 牛華星 張志民 劉霄飛 劉道中（山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 山東 濟南 250022）

內(nèi)標法和外標法測定氟尼辛葡甲胺注射液含量的比較分析

章安源 馮 濤 陳 玲 李淑花 牛華星 張志民 劉霄飛 劉道中（山東省獸藥質(zhì)量檢驗所 山東 濟南 250022）

比較內(nèi)標定量法和外標定量法在測定氟尼辛葡甲胺注射液含量的差異。運用高效液相色譜法對樣品進行分析，然后分別采用內(nèi)標法和外標法計算其含量。內(nèi)標法的準確度和精密度均優(yōu)于外標法，內(nèi)標法和外標法之間無顯著性差異。高效液相色譜法分析含量，采用內(nèi)標法和外標法的定量方式獲得的結(jié)果均能滿足檢測要求。分析人員可根據(jù)實際情況視實驗室條件而使用相應(yīng)的定量方式。

氟尼辛葡甲胺注射液 含量 高效液相色譜法 內(nèi)標法 外標法

氟尼辛葡甲胺注射液含量能準確定量分析的標準方法是《2010版藥典》高效液相色譜法內(nèi)標定量，雖然內(nèi)標法是標準的實驗方法，但操作過程較復(fù)雜，并且還需要使用內(nèi)標物。為求實驗方法簡便、快捷、準確，以提高效率，本文采用外標定量法來檢測同一規(guī)格、10個廠家共計10批的氟尼辛葡甲胺注射液含量，并和內(nèi)標定量法做出比較，測定結(jié)果無顯著性差異，在檢測大批量的樣品時，外標法為工作帶來了實效。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

WatersE2695高效液相色譜儀，waters2998紫外檢測器；氟尼辛葡甲胺對照品(中國獸藥藥品監(jiān)察所，批號H0611111，含量99.9%)。氟尼辛葡甲胺注射液(不同廠家規(guī)格相同(5%)10批：批號分別為(2013)2251山東天振藥業(yè)有限公司、(2013)4486齊魯動物保健品有限公司、(2013)5230山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司、(2013)5824煙臺綠葉動物保健品有限公司、(2013)7696山東誼源動物藥業(yè)有限公司、(2014)0211文登市雨澤銀豐動物藥業(yè)有限公司、(2014)0688齊魯動物保健品有限公司、(2014)2773濰坊富邦藥業(yè)有限公司、(2014)2929山東中牧獸藥有限公司、(2014)3406文登市雨澤銀豐動物藥業(yè)有限公司)。甲醇(色譜純)水為三級水，其余試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters symmetryC18.5μm 4.8×150mmm columon；流動相：甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)；柱溫：25℃；檢測波長：254nm；流速：1.0mol/L/min；進樣體積：20μl。

1.3 內(nèi)標法

1.3.1 內(nèi)標溶液的制備[1]取苯甲酸鈉適量，加水溶解并稀釋制成每1ml中含33mg的溶液，作為內(nèi)標溶液。

1.3.2 校正因子[1]的測定 另取氟尼辛葡甲胺對照品約83mg(約相當于氟尼辛50mg)，精密稱定，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，精密加入內(nèi)標溶液5ml，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水（7∶3）稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，計算校正因子。

1.3.3 供試品溶液制備 精密量取本品適量(約相當于氟尼辛50mg)，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，精密加入內(nèi)標溶液5ml，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，測定、計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗[2]

用內(nèi)標法分別對10個相同規(guī)格的氟尼辛葡甲胺供試品進行測定；按照內(nèi)標溶液的制備方法，取內(nèi)標溶液苯甲酸鈉10μl加入供試品中，內(nèi)標溶液出峰快，見圖1.內(nèi)標峰和氟尼辛葡甲胺注射液對照品、供試品完全分離。見圖2，圖3。

圖1 苯甲酸鈉內(nèi)標

圖2 內(nèi)標法-氟尼辛葡甲胺對照品

圖3 內(nèi)標法-供試品(4486齊魯動物保健品有限公司)

2.2 外標法

2.2.1 對照品溶液 取對照品50mg，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖4。

2.2.2 供試品溶液 約相當于氟尼辛50mg，置50ml量瓶中，加適量甲醇-水(7∶3)使溶解，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀釋至刻度，搖勻，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖5。

圖4 外標法-氟尼辛葡甲胺對照品

圖5 外標法-供試品(4486齊魯動物保健品有限公司)

2.3 線性關(guān)系分析

精密稱取氟尼辛葡甲胺對照品適量，分別制成濃度為0.5、1、2、4、20、40、80μg/ml的溶液，按照外標含量測定項下的方法進行測定，取以上7個濃度對照品5μl注入液相色譜儀，平行進樣各兩次，以兩次峰面積平均值為縱坐標，以濃度C(μg/ml)為橫坐標(見圖5），并進行統(tǒng)計學(xué)處理，得到氟尼辛葡甲胺對照品的回歸方程為y=0.0245x-0.0056 (R2=0.9996，n=7)，線性范圍為0.5～80μg/ml。表明線性良好。

2.4 精密度

取對照品溶液在上述色譜條件下，重復(fù)進樣6次，每次1μl，峰面積的RSD為0.3%。

2.5 重復(fù)性

取同一供試品(4486齊魯動物保健品有限公司)約1g，精密稱定，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，測定，結(jié)果平均含量為99.2%，RSD為1%，重復(fù)性好。

圖5 氟尼辛葡甲胺對照品標準曲線

2.6 穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，間隔0,1,2,4,6,8,10h分別記錄，記錄峰面積，結(jié)果RSD為3%，表明被測溶液在10h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 含量結(jié)果

2.7.1 內(nèi)標法、外標法含量 參照《中國獸藥典2010》二部對氟尼辛葡甲胺注射液含量測定方法(內(nèi)標法)及外標法對收集的樣品進行含量測定，每個供試品進樣6次。含量結(jié)果見表1。

表1 內(nèi)標法與外標法測定氟尼辛葡甲胺甲胺注射液含量 (%)

內(nèi)標法和外標法的相對偏差無規(guī)律，相對偏差集中在0.27%～1.84%之間，偏差幅度不一致，表明內(nèi)標法與外標法之間不可能存在系統(tǒng)誤差。

2.7.2 精密度和準確度的比較 對內(nèi)標法和外標法測得的氟尼辛葡甲胺含量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，相對標準偏差(RSD)和準確度等數(shù)據(jù)列于表2.內(nèi)標法和外標法測得的10個樣品含量水平的RSD和相對誤差均小于5%，滿足檢測工作需要。但內(nèi)標法的RSD顯然小于外標法的RSD，即精密度方面內(nèi)標法優(yōu)于外標法；準確度方面，內(nèi)標法也要優(yōu)于外標法。

2.7.3 顯著性差異分析 對內(nèi)標法和外標法測得的氟尼辛葡甲胺注射液含量數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，以判斷兩者之間是否存在顯著性差異[3]，結(jié)果見表2。顯然，內(nèi)標法和外標法測得的10組數(shù)據(jù)之間無顯著差異(P＞0.05)。

3 結(jié)論

3.1 外標法的優(yōu)缺點 外標法操作簡便，十分合適大量樣品分析。但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與對照品相同的操作條件下進行，分析誤差易人為造成，經(jīng)常得不到準確的測量結(jié)果。每次樣品分析的相同的操作條件下進行很難完全相同，如流動相的配制、室溫、檢測器的響應(yīng)性能等，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結(jié)果。

表2 內(nèi)標法與外標法測定氟尼辛葡甲胺注射液含量結(jié)果統(tǒng)計分析(%)

3.2 內(nèi)標法的優(yōu)缺點 測定的結(jié)果較為準確，由于通過測量內(nèi)標物(即校正因子)及欲測組分的峰面積的相對值來進行計算，因而在一定程度上消除了操作條件(如進樣量的變化、色譜條件的微小變化)等的變化所引起的誤差，別是在樣品前處理前加入內(nèi)標物，然后再進行前處理，可部分補償欲測組分在樣品前處理時的損失。內(nèi)標法結(jié)果的精密度和準確度均較好，但操作較為麻煩。

內(nèi)標與外標都是定量的一種方法，應(yīng)用內(nèi)標法和外標法分析氟尼辛葡甲胺注射液的含量結(jié)果，本試驗兩者之間也不存在顯著性差異(P＞0.05)。本試驗內(nèi)外標法的準確度、精密度均滿足檢測工作需要(RSD＞0.05)，至于哪一種方法好不能一概而論，應(yīng)根據(jù)不同的分析要求，以及實驗室的條件(如有無自動進樣設(shè)備、有無所需的試劑)等情況來決定。應(yīng)用外標法如果能夠滿足要求，可以優(yōu)先考慮外標法，簡單而省事，進樣體積的重現(xiàn)性很好，不用內(nèi)標也具很好的分析精度，加入內(nèi)標反而對分析不利[4]。對于精密度要求比較高、結(jié)果準確度會產(chǎn)生重大影響、實驗室條件不是很理想的條件下，用內(nèi)標法還是必要的。無論應(yīng)用那種定量方法，都應(yīng)做好方法的驗證和確認工作，只要是按照程序經(jīng)過驗證和確認的方法，都可以應(yīng)用[5]。

[1] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典2010版2部[S].

[2] 邱凈英, 梁光義, 蔣品等. 高效毛細管電泳內(nèi)標法與外標法含量測定的比較[J]. 光譜實驗室, 2012, 29(5)∶ 2616-2621.

[3] 徐靜, 黃建軍. 氣相色譜檢測白酒中乙酸乙酯內(nèi)標法和外標法的比較研究[J]. 柳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報, 2006, 6(4)∶ 61-63.

[4] 涂新軍, 譚奧, 徐明輝. 內(nèi)標法在液相色譜應(yīng)用中的局限性[J]. 中國藥事, 1998, 12(6)∶ 387-388.

[5] 黃誠, 盧麗明, 劉國平. 內(nèi)標法和外標法測定血液中乙醇含量的比較分析[J]. 生命科學(xué)儀器, 2008,6(3)∶ 41-43.

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1007-1733(2014)11-0003-03

2014–08–12）