雞腸毒綜合癥病因研究報(bào)告(二)—細(xì)菌和原蟲的分離鑒定

何雷堂 （河南省鶴壁市畜牧局 458030） 何麗麗 （河南省鶴壁市淇濱區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心）朱擁軍 （河南省?？h新鎮(zhèn)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站） 張艷瑞 李淑沛 （河南省鶴壁市雨田獸藥經(jīng)營部）

雞腸毒綜合癥病因研究報(bào)告(二)—細(xì)菌和原蟲的分離鑒定

何雷堂 （河南省鶴壁市畜牧局 458030） 何麗麗 （河南省鶴壁市淇濱區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心）朱擁軍 （河南省?？h新鎮(zhèn)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站） 張艷瑞 李淑沛 （河南省鶴壁市雨田獸藥經(jīng)營部）

選取18個(gè)發(fā)生腸毒綜合癥的雞場進(jìn)行細(xì)菌分離和球蟲卵囊鏡檢。結(jié)果分離出大腸桿菌(16個(gè)場)、雞白痢菌(1個(gè)場)、副傷寒菌(4個(gè)場)、禽霍亂菌(2個(gè)場)、魏氏梭菌(1個(gè)場)、球蟲卵囊(1個(gè)場)。分離到的細(xì)菌和球蟲通過消化道傳播，呈現(xiàn)點(diǎn)發(fā)、散發(fā)規(guī)律，很少出區(qū)域性流行，與腸毒綜合癥流行規(guī)律不一致，據(jù)此推斷細(xì)菌或球蟲不是腸毒綜合癥的原發(fā)病因。

腸毒綜合癥 病因

雞腸毒綜合癥自發(fā)現(xiàn)以來，在獸醫(yī)臨床上一直不間斷的發(fā)生，以前呈現(xiàn)散發(fā)、點(diǎn)發(fā)現(xiàn)象，近年來呈現(xiàn)大面積流行。并呈現(xiàn)以下共性特征：（1）癥狀典型：料糞、肉便、采食量降低；（2）治療特點(diǎn)明顯：治療有效、不去病根、反復(fù)發(fā)??；（3）發(fā)生率高。幾乎90%以上的雞場都不同程度的發(fā)生該??；（4）病因解釋多種多樣，計(jì)19種之多，囊括了細(xì)菌、病毒、寄生蟲、營養(yǎng)、環(huán)境、毒素等能引起致病的各個(gè)方面，其中權(quán)威解釋是“魏氏梭菌和小腸球蟲混合感染”；（5）隱性損失大。表現(xiàn)在飼料轉(zhuǎn)化率低，生長緩慢，后期往往與大腸桿菌、新城疫混合感染，造成死亡上升。這個(gè)病對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展已構(gòu)成了重大威脅。筆者長年工作在獸醫(yī)臨診一線，從2007年開始，對發(fā)生腸毒綜合癥的雞群從細(xì)菌、病毒、寄生蟲等方面進(jìn)行了研究，最后弄清了腸毒綜合癥的病因。

1 材料和方法

1.1 細(xì)菌分離

1.1.1 病料 無菌取出的病死雞肝臟、脾臟，涂抹于培養(yǎng)基表面，置于37℃培養(yǎng)，分別有有氧和厭氧條件下培養(yǎng)，之后挑出單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基。同時(shí)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，以期發(fā)現(xiàn)厭氧菌。

1.1.3 鏡檢、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn) 所有分離菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，懸滴鏡檢，純培養(yǎng)后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和生化試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)用紙片法，生化試驗(yàn)用生化微量管進(jìn)行。

1.2 小腸球蟲的檢查

飽和鹽水漂浮法：飽和鹽水的配制方法：用500ml水加氯化鈉約180g，使其充分?jǐn)噭蛉芑闯伞Ｈ⌒迈r的雞糞5～10g或小腸內(nèi)容物，放入小玻璃杯內(nèi)，然后加少量飽和鹽水混勻，靜置15～30min左右，此時(shí)球蟲卵即飄浮至液面上，再用直徑8mm左右的鉑絲環(huán)，平行接觸液面，沾取一層水膜，將此水膜抖在載玻片上，然后，加蓋玻片進(jìn)行鏡檢。

2 結(jié)果

4年內(nèi)，先后對18個(gè)雞場的病料進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定情況匯總?cè)绫?。

表1 18個(gè)雞場分離細(xì)菌情況匯總表

2.1 大腸桿菌的分離結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)特性 營養(yǎng)瓊脂上，菌落形態(tài)是：圓形微凸起、表面光滑濕潤、淺灰色、半透明。在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小、表面光滑濕潤的粉紅色菌落。

2.1.2 鏡檢 分離菌呈革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓的短桿菌。用懸滴法做細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性檢查，可發(fā)現(xiàn)細(xì)菌快速移動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)，證明有鞭毛。

2.1.3 生化試驗(yàn)

表2 大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，這16株分離菌能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，M.R.陽性，V.P.陰性，蛋白胨水呈陽性，符合大腸桿菌的生化特征。鑒定該菌為大腸桿菌。

2.1.4 藥敏試驗(yàn) 挑出4株分離菌，在麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表3。

表3 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑) (mm)

由表3可知，分離的大腸桿菌的耐藥譜較廣。試驗(yàn)所用4個(gè)菌株均對磷霉素鈉高度敏感；對丁胺卡那霉素中度敏感；部分菌株對痢特靈中度敏感；對其它8種藥物均不敏感。

2.2 雞白痢沙門氏菌、雞副傷寒沙門氏菌的分離、鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特性 麥康凱培養(yǎng)基上菌落呈透明、無色、圓形凸起，直徑為1～2mm。在普通瓊脂上，菌落分散，光滑，閃光，透明，微隆起。

2.2.2 鏡檢 分離菌呈紅色、兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，單個(gè)、成對或成叢分布，形態(tài)均一。懸滴法檢查，有的分離菌株能運(yùn)動(dòng)。凡是能運(yùn)動(dòng)的統(tǒng)認(rèn)定為雞副傷寒沙門氏菌。

2.2.3 生化試驗(yàn) 挑取以上麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上無色小菌落，作革蘭氏染色，選擇革蘭氏陰性菌落，分別斜面上畫線，于37℃培養(yǎng)24h。用接種針挑取純培養(yǎng)物接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、肌醇、鼠李糖、H2S和木糖等生化試驗(yàn)管，各接種3管，37℃培養(yǎng)24h，觀察反應(yīng)情況。

表4 雞白痢、雞副傷寒沙門氏菌生化試驗(yàn)

由表4中可以看到S1為雞白痢沙門氏菌，S2～S5為雞副傷寒沙門氏菌。生化試驗(yàn)結(jié)果符合沙門氏菌的特性，從而證明分離菌均為沙門氏菌，命名為S1、S2、S3、S4、S5。

2.2.4 藥敏試驗(yàn)

表5 雞白痢、雞副傷寒沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)(抑菌圈直徑) (mm)

卡那霉素 8 N 9 N 12 M 10 N慶大霉素 7 N 8 N 7 N 8 N氟哌酸 6 N 6 N 6 N 6 N丁胺卡那霉素 22.5 G 21.7 G 22.3 G 21.1 G磷霉素 16 G 17 G 15 M 13 M痢特靈 12 M 13 M 11 M 16 G

從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來看，四株沙門氏菌對丁胺卡那霉素高敏，部分菌株對磷霉素、痢特靈高敏，其它藥物大多數(shù)為不敏感，少部分為中敏。

2.3 禽霍亂(巴氏桿菌)的鑒定試驗(yàn)

2.3.1 培養(yǎng)特性 菌落圓形，光滑，半透明，在鮮血瓊脂平板上無溶血現(xiàn)象，在普通平板上生長貧瘠，形成細(xì)小的菌落，在麥康凱瓊脂平板上不生長。

2.3.2 鏡檢 將細(xì)菌純培養(yǎng)物制片，革蘭氏染色，為陰性細(xì)菌，用美藍(lán)或瑞氏染色法染色，顯微鏡檢查，可見兩極著色的卵圓形短桿菌。懸滴檢查，無運(yùn)動(dòng)性。

2.3.3 生化試驗(yàn)

表6 禽霍亂(巴氏桿菌)的生化試驗(yàn)結(jié)果

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果如上，生化試驗(yàn)結(jié)果符合巴氏桿菌的特性，從而證明分離菌為巴氏桿菌，命名為B1、B2。

2.3.4 藥敏試驗(yàn)

表7 禽霍亂(巴氏桿菌)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 (mm)

可見兩株巴氏桿菌均對氟苯尼考、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、磷霉素高度敏感，對痢特靈、紅霉素、氟哌酸、青霉素不敏感。而對鏈霉素呈現(xiàn)不同的敏感性。

2.4 魏氏梭菌的分離和鑒定

2.4.1 培養(yǎng)特性 鮮血瓊脂上可見灰白色、圓形、光滑、邊緣呈鋸齒狀的直徑2～4mm的大菌落，周圍可見溶血環(huán)。無菌采集腸內(nèi)容物直接接種于厭氧肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，產(chǎn)生大量惡臭氣體，培養(yǎng)物混濁。挑一鉑金耳培養(yǎng)液涂片鏡檢，可見大量較純的魏氏梭菌。

2.4.2 病料鏡檢 用無菌術(shù)取病死雞的腸壁刮取物抹片革蘭氏染色鏡檢，見大量兩端稍鈍圓粗短和部份有芽胞的革蘭氏陽性梭菌，單獨(dú)或成雙排列，亦有呈短鏈者。

2.4.3 生化鑒定 可見分離出的細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，不發(fā)酵甘露醇。

2.4.4 藥敏試驗(yàn) 用常規(guī)紙片法將分離的細(xì)菌做6種藥敏感性試驗(yàn)，其抑菌圈直徑分別為：青霉素17mm、慶大霉素16mm屬于高敏；林可霉素9mm屬于低敏；氟哌酸、鏈霉素與磺胺嘧啶為6mm，不敏感。

2.5 小腸球蟲卵囊

在檢驗(yàn)的18個(gè)雞場中，只有?？h小河鄉(xiāng)梨園村鄭良慶雞場檢出了球蟲卵囊，而其它17個(gè)雞場未檢出。

3 討論

（1）18個(gè)雞群中分離出了16株大腸桿菌，1株雞白痢菌，4株副傷寒菌，2株禽霍亂菌，1株魏氏梭菌，1株小腸球蟲。這些細(xì)菌性或原蟲性疾病單獨(dú)發(fā)生時(shí)，不會出現(xiàn)本文中所述的腸毒綜合癥的癥狀，說明腸毒綜合癥的發(fā)生另有病因，這些細(xì)菌性疾病或原蟲疾病只是以并發(fā)病或繼發(fā)病的身份出現(xiàn)。（2）腸毒綜合癥有一個(gè)十分明顯的特點(diǎn)：發(fā)生率高。有時(shí)在一個(gè)村、鄉(xiāng)或縣域內(nèi)，幾乎90%以上的雞場都不同程度的發(fā)生該病。細(xì)菌和小腸球蟲是通過飲水和飼料，而非空氣進(jìn)行傳播，因此，上述分離到的細(xì)菌和小腸球蟲在一個(gè)地方不會造成大面積流行，而只是呈現(xiàn)點(diǎn)發(fā)病例。從這一點(diǎn)上看，分離的細(xì)菌或原蟲也不會是腸毒綜合癥的原發(fā)病因。

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2014–07–08）