UPLC法測定水產(chǎn)品中磺胺類藥物改進

陳永平+張素青+李連慶+李春青+馬丹+高麗娜+張萍

DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2014.02.008

摘 要：改進了水產(chǎn)品中磺胺類藥物測定-超高效液相色譜法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取、流動相稀釋后進高效液相色譜儀進行檢測分析。色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3( 1.8 μm，2.1×100 mm) 色譜柱，流動相為甲醇與0.2%甲酸水，檢測波長范圍270 nm，柱溫40 ℃，進樣量為4 μL，磺胺類藥物在0.01～0.5 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。該方法簡便、準確，可以準確地判斷水產(chǎn)品中磺胺類藥物，并進行定量計算。

關鍵詞：磺胺類藥物；超高效液相色譜；水產(chǎn)品

磺胺類藥物是常用的廣譜抗菌藥[1]。因其具有抗菌譜廣、高效、低毒和價格低廉等特點，在動物養(yǎng)殖中被廣泛使用。人類經(jīng)常食用有磺胺類藥物殘留的動物源性食品，可能引起磺胺類藥物在體內(nèi)的逐漸累積。其危害性主要表現(xiàn)為細菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌作用等[2-3]。目前中國、歐盟、美國、日本等均將磺胺類藥物列為動物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物，最大殘留限量一般為50～100 μg/kg。測定動物組織中磺胺類藥物的分析方法較多，包括毛細管電泳法，液相色譜法，氣相色譜法，液相色譜-質(zhì)譜法等[4-9]，應用最廣泛的主要為液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜法。有些方法前處理復雜，上機分析時間較長或成本較高影響了實驗效率。本研究通過優(yōu)化流動相、前處理提取試劑，建立的方法具有提取簡單、凈化速度快、實驗周期短、回收率高、價格低廉等優(yōu)點，可以滿足檢測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器設備Waters UPLC 超高效液相色譜，二極管陣列檢測器，Empower2 色譜工作站（購自Waters科技有限公司）；MILIPORE超純水器；METTLER XP205 電子天平（梅特勒-托利多公司，0.001 g），旋渦混合器（上?？等A儀器制造廠），均質(zhì)器（飛利浦公司，轉(zhuǎn)速10 000 r/min），離心機(Sigma公司，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

乙酸乙酯(TEDIA)、甲醇(TEDIA)、正己烷(TEDIA)、異丙醇(TEDIA)均為色譜純，甲酸(優(yōu)級純)，超純水。

磺胺標準品:磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺多辛、磺胺異噁唑、磺胺喹噁啉，純度均不小于98.0%。

標準儲備液：稱取各磺胺標準品10 mg(精確至0.01 mg)，用甲醇分別溶解并定容至10 mL，各磺胺標準儲備液濃度為1 000 mg/L。避光4 ℃冷藏保存，保存期為1個月。

混合標準中間液：適量移取各標準儲備液，用甲醇稀釋并定容至10 mL，在室溫下混勻。其中磺胺嘧啶10 mg/L、磺胺噻唑10 mg/L、磺胺甲基嘧啶10 mg/L、磺胺二甲基嘧啶10 mg/L、磺胺甲基異噁唑20 mg/L、磺胺多辛20 mg/L、磺胺異噁唑20 mg/L、磺胺喹噁啉20 mg/L。避光4 ℃冷藏保存，保存期為1周。

混合標準使用液：取混合標準中間液1.25 mL，用流動相稀釋并定容至100 mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉；蝦，去頭、去殼、去腸線，取肌肉部分；樣品切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后混合。

1.2.2 提取 將樣品解凍，稱取5.00 g，置于50 mL玻璃離心管。然后加入25 mL乙酸乙酯，超聲1 min，均質(zhì)機14 000 r/min均質(zhì)1 min，漩渦混勻1 min，9 000 r/min離心5 min，將乙酸乙酯過無水硫酸鈉柱到100 mL梨形瓶中。再向原離心管中加入25 mL乙酸乙酯，旋渦混勻1 min，9 000 r/min離心5 min，將乙酸乙酯層過無水硫酸鈉合并于100 mL梨形瓶中，清洗液合并于梨形瓶中于40 ℃水浴中減壓濃縮至近干，先加入1 mL流動相，再加入2 mL正己烷，渦旋1 min，轉(zhuǎn)移至離心管中4 000 r/min離心3 min，棄正己烷，底層過0.25 μm濾膜，待上機。

1.2.3 色譜條件ACQUITY UPLC HSS T3 ( 1.8 μm，2.1×100 mm) 色譜柱；檢測波長：270 nm，柱溫40 ℃，進樣量為4 μL；流動相A 相:0.2%甲酸水溶液，B 相: 甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

時間/min 流速/mL?min-1 A% B%

初始 0.4 80 20

0.500.4 80 20

3.200.4 70 30

5.500.4 30 70

6.000.4 80 20

7.000.4 80 20

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

試驗分別采用乙腈與乙酸銨溶液、甲醇與乙酸銨溶液、甲醇與0.1%甲酸水、甲醇與0.2%甲酸水作為流動相，實驗結果表明：甲醇與0.2%甲酸水流動相系統(tǒng)梯度洗脫，各組分色譜峰型、響應值與分離度最好。實驗選擇甲醇與0.2%甲酸水作為流動相，梯度洗脫，7 min即可完成分析。

2.2 樣品提取條件的選擇

試驗分別采用乙腈-氯仿（10∶1）、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈作為提取劑，實驗結果表明：采用乙酸乙酯作為提取劑各組分回收率均在80%～120%之間，回收效果明顯好于其他提取劑，雜質(zhì)干擾小，各組分分離度好。所以本方法選擇乙酸乙酯作為提取劑。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

圖1 8種磺胺標準圖

圖2 魚樣空白色譜圖

圖3 魚肉樣品添加色譜圖

0.2%甲酸水-甲醇( 80: 20) 將標準溶液分別配制成外標濃度為10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，500.0 ng/mL的標準工作液進樣分析，以外標濃度為橫坐標，響應值為縱坐標，繪制得8種磺胺的標準曲線線性良好，其相關系數(shù)在0.998 0～0.999 9 之間。方法檢出限( LOD) 以空白樣品基質(zhì)稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比S/N＝3 計算得出10.0 μg/kg。定量限( LOQ) 是以空白樣品基質(zhì)稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比S/N＝10 計算得出25 μg/kg。

2.4 添加回收率驗證

取空白魚樣品分別向其中加入50 μg/kg、100 μg/kg 和200 μg/kg 濃度的磺胺類藥物混合標準溶液。進行提取、凈化及色譜分析。每個添加水平作5 份平行測定，結果表明: 平均回收率為78.5%～95.7%，相對標準偏差為2.8%～10.3%，結果見表2。

試驗結果表明，用超高效液相色譜－二極管陣列檢測器檢測水產(chǎn)品中磺胺類藥物，靈敏度高，檢測限低，線性、回收率均符合標準要求。

表2 試樣加標回收率和重復測定的相對標準偏差

添加濃度/

μg?kg-1 測定參數(shù)/% 磺胺嘧啶 磺胺噻唑 磺胺甲

基嘧啶 磺胺二甲

基嘧啶 磺胺甲基

異噁唑 磺胺

多辛 磺胺

異噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

參考文獻：

[1] 白麗麗，戴華，林正峰.高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蝦中9 種磺胺類藥物的殘留[J].藥品鑒定，2011,18（23）:60-62

[2] 段振娟,張鴻雁,王碩.動物性食品中磺胺類藥物殘留分析研究進展[J].食品研究與開發(fā),2007,28(6):149-152

[3] 萬春花,龍洲雄.磺胺類藥物殘留的色譜分析進展[J].現(xiàn)代科學儀器,2008,18(2):99-104

[4] 游輝,于輝,武顏文,等.快速溶劑萃取-高效液相色譜法同時測定牛肉中5 種磺胺類藥物殘留[J].化學通報,2010,73(9):854-857

[5] 劉正才,楊方,余孔捷,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測鰻魚中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素族抗生素藥物殘留[J].食品科學,2009,30(14):167-170

[6] 李玉琴,張傳港,宗素艷,等.高效毛細管電泳法測定磺胺類藥物的離解常數(shù)及其制劑的含量[J].藥物分析雜志,2008,28(2):243～246

[7] 黃德鳳,戚雋淵,孫建華,等.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中19種磺胺類藥物殘留量[J].水產(chǎn)科技情報,2012,40(3):148-151

[8] 吳淑秀，公茂金，朱萬燕,等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和豬肝中9種磺胺類藥物的殘留[J].分析試驗室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏慶，王穎，張丹,等.高效液相色譜—紫外法對13種磺胺類藥物的同步檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)2012, 39（4）:233-237

Improvement of determination of sulfa drugs residues in

aquatic products by UPLC method

CHEN Yong

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Ping, ZHANG Su

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Qing, LI Lian

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Qing,

LI Chun

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Qing, MA Dan，GAO Li

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Na,ZHANG Ping

(Super ision and test Center for f isheries Environment and Quality of f ishery products of Ministry Ag riculture Tian Jin 300221)

Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

Key words：sulfonamides;UPLC;Aquatic products

（收稿日期：2013-11-24）

本刊為北京萬方數(shù)據(jù)股份有限公司、萬方數(shù)據(jù)電子出版社，中國學術期刊（光盤版）電子雜志社，中文科技期刊數(shù)據(jù)庫，中國核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫入選期刊，并由其對外提供信息服務，相關著作權使用費和稿費由本刊一并支付，如有異議，請在來稿時注明，本刊將作適當處理?！逗颖睗O業(yè)》編輯部

基嘧啶 磺胺甲基

異噁唑 磺胺

多辛 磺胺

異噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

參考文獻：

[1] 白麗麗，戴華，林正峰.高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蝦中9 種磺胺類藥物的殘留[J].藥品鑒定，2011,18（23）:60-62

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[4] 游輝,于輝,武顏文,等.快速溶劑萃取-高效液相色譜法同時測定牛肉中5 種磺胺類藥物殘留[J].化學通報,2010,73(9):854-857

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[6] 李玉琴,張傳港,宗素艷,等.高效毛細管電泳法測定磺胺類藥物的離解常數(shù)及其制劑的含量[J].藥物分析雜志,2008,28(2):243～246

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[8] 吳淑秀，公茂金，朱萬燕,等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和豬肝中9種磺胺類藥物的殘留[J].分析試驗室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏慶，王穎，張丹,等.高效液相色譜—紫外法對13種磺胺類藥物的同步檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)2012, 39（4）:233-237

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LI Chun

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Na,ZHANG Ping

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Abstract：A method of UPLC-PDA for determination of sulfonamides in Aquatic products was developed.The liquid chromatography separation was carried on ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm,2.1×100 mm) with Methanol-0.2% Formic acidsystem as mobile phase.The wavelength range was 270 nm.The calibration curve was linear in the range of 0.01～0.5 μg/mL.The method was simple, and would accurately determine sulfonamides in in Aquatic products．

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基嘧啶 磺胺甲基

異噁唑 磺胺

多辛 磺胺

異噁唑 磺胺喹

噁啉

50 平均回收率

RSD 81.2

4.4 85.4

3.5 79.7

2.8 86.3

5.2 82.2

4.7 78.5

4.5 87.1

5.6 84.6

6.4

100 平均回收率

RSD 85.5

5.9 89.3

4.2 83.3

6.5 91.6

7.3 85.4

5.4 83.7

9.6 92.4

8.3 89.2

3.9

200 平均回收率

RSD 89.5

5.3 93.3

7.1 90.3

8.8 94.6

4.5 88.4

6.5 85.9

10.3 80.8

5.7 95.7

6.3

參考文獻：

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[3] 萬春花,龍洲雄.磺胺類藥物殘留的色譜分析進展[J].現(xiàn)代科學儀器,2008,18(2):99-104

[4] 游輝,于輝,武顏文,等.快速溶劑萃取-高效液相色譜法同時測定牛肉中5 種磺胺類藥物殘留[J].化學通報,2010,73(9):854-857

[5] 劉正才,楊方,余孔捷,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測鰻魚中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素族抗生素藥物殘留[J].食品科學,2009,30(14):167-170

[6] 李玉琴,張傳港,宗素艷,等.高效毛細管電泳法測定磺胺類藥物的離解常數(shù)及其制劑的含量[J].藥物分析雜志,2008,28(2):243～246

[7] 黃德鳳,戚雋淵,孫建華,等.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中19種磺胺類藥物殘留量[J].水產(chǎn)科技情報,2012,40(3):148-151

[8] 吳淑秀，公茂金，朱萬燕,等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和豬肝中9種磺胺類藥物的殘留[J].分析試驗室, 2012, 31（2）:79-83

[9] 傅宏慶，王穎，張丹,等.高效液相色譜—紫外法對13種磺胺類藥物的同步檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)2012, 39（4）:233-237

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