馬曉琴等

摘要：為了研究牦牛雜交雄性不育的分子機(jī)制，采用3′-RACE方法分別從牦牛、黃牛睪丸組織的總RNA中獲取其Prdm9基因的部分cDNA序列，長(zhǎng)度分別為1 548、1 392 bp，包含全部的鋅指域。對(duì)比分析顯示：牦牛、黃牛的Prdm9基因均含有5個(gè)連續(xù)的C2H2型鋅指，每個(gè)鋅指均由21個(gè)氨基酸構(gòu)成，鋅指間是高度保守序列TGEKPYV，并且鋅指域從這段高度保守序列開(kāi)始；牦牛、黃牛各自Prdm9基因中的5個(gè)鋅指間在氨基酸構(gòu)成上存在差異，并且二者在整個(gè)鋅指域上有6個(gè)氨基酸差異，其中5個(gè)都在鋅指中的重要正向選擇位點(diǎn)處，推測(cè)這些氨基酸差異可能與牦牛種間雜交后代的雄性不育有關(guān)。

關(guān)鍵詞：牦牛；黃牛；雜交雄性不育；睪丸；Prdm9基因

中圖分類號(hào)： S823.8+52；S823.8+12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0028-02

收稿日期：2013-12-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31240053）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助課題（編號(hào)：12NZYTH06），西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目（編號(hào)：CX2013SZ55）。

作者簡(jiǎn)介：馬曉琴（1987—），女，甘肅武威人，碩士，主要從事動(dòng)物生物化學(xué)與分子遺傳學(xué)研究。E-mail：maxiaoqin1987@hotmail.com。

通信作者：鄭玉才（1965—），男，內(nèi)蒙古海拉爾人，博士，教授，主要從事牦牛的研究。E-mail：yucaizheng65@hotmail.com。牦牛（Bos grunniens）主要分布在我國(guó)海拔3 km以上的青藏高原，是該地區(qū)主要的家畜。牦牛與普通牛（Bos taurus）的種間雜交后代稱犏牛，犏牛雖然具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，但卻表現(xiàn)為雄性不育，犏牛雄性不育的缺陷制約了其雜種優(yōu)勢(shì)的利用，但是其機(jī)理尚不清楚。在雜交雄性不育的機(jī)制研究方面，20世紀(jì)70年代就發(fā)現(xiàn)了雜交不育-1（hybrid sterility-1，hst1）基因，2009年證實(shí)該基因就是Prdm9（PR domain containing 9）。Prdm9是催化組蛋白H3的4位賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶，該基因不但是人類、小鼠減數(shù)分裂期重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和重組熱點(diǎn)定位的主控因子，而且是迄今為止報(bào)道的唯一與哺乳動(dòng)物雜種不育相關(guān)的基因[1-3]。PRDM9蛋白能夠通過(guò)其高度重復(fù)的鋅指域結(jié)合特定DNA序列，從而使結(jié)合該蛋白較多的區(qū)域成為同源重組熱點(diǎn)區(qū)域[4]。Prdm9基因可限制家鼠亞種之間的雜交，敲出、插入或缺失1個(gè)鋅指都可導(dǎo)致小鼠的雜交不育[2]。Prdm9基因只在雌、雄性小鼠進(jìn)入減數(shù)分裂前期的生殖細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[3]，其發(fā)現(xiàn)為研究雜交不育提供了新的思路。本研究對(duì)牦牛、黃牛Prdm9基因的鋅指域cDNA序列進(jìn)行克隆和序列比對(duì)分析，以期為揭示牦牛種間雜交后代雄性不育的機(jī)制提供參考資料。

1材料與方法

1.1樣品的采集

于2012年11月在四川省青白江象牙牛市選擇健康的成年麥洼公牦牛（4～6歲，n=3）和公黃牛（4～6歲，n=3）。屠宰后30 min內(nèi)迅速取出其睪丸組織并浸入RNAlater溶液中，冰浴條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，用于提取RNA。

1.2試劑與儀器

主要試劑包括：TRIzol、RNAlater，購(gòu)自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司。引物的合成與測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成。

主要儀器包括：PowerPac 3000電泳儀，Bio-Rad公司；Versa Doc1000凝膠成像系統(tǒng)；WPA Biowave核酸蛋白檢測(cè)儀；Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR儀。

1.3睪丸組織總RNA的提取

參照TRIzol試劑（Invitrogen公司）的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，從牦牛、黃牛的睪丸組織中提取總RNA，用WPA Biowave核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定提取的RNA濃度和純度。

1.4牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列的克隆測(cè)序與分析

采用3′-RACE方法擴(kuò)增牦牛、黃牛Prdm9基因的鋅指序列。先使用3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 試劑盒反轉(zhuǎn)錄3′-RACE的cDNA第一條鏈，然后再進(jìn)行3′-RACE PCR擴(kuò)增，技術(shù)流程和操作方法參照說(shuō)明書(shū)。根據(jù)牦牛的Prdm9 mRNA的部分序列（GenBank登錄號(hào)：JX454531），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異上游引物（Prdm9-F1：TGCTCTCTGGCCTTCTCCAGTCAGAAGTTC），匹配試劑盒自帶的下游引物，分別擴(kuò)增牦牛、黃牛的Prdm9基因鋅指序列。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 3.5 min；95 ℃ 30 s，68 ℃ 3.5 min，38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用膠回收試劑盒純化回收特異條帶。將回收的DNA片段與載體pMD19-T連接，再轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌DH5α中進(jìn)行克隆，最后分別挑選4個(gè)牦牛、黃牛的陽(yáng)性克隆，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序的結(jié)果采用Primer Premier 50軟件翻譯成氨基酸，再用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1牦牛、黃牛Prdm9基因部分序列的擴(kuò)增

經(jīng)檢測(cè)，提取的RNA純度和濃度達(dá)到了RACE擴(kuò)增要求。由圖1可見(jiàn)，用3′-RACE法分別從牦牛、黃牛睪丸組織中獲得了約1 500、1 400 bp的特異擴(kuò)增條帶。測(cè)序結(jié)果表明，這2個(gè)條帶為Prdm9基因的部分片段，長(zhǎng)度分別為1 548、1 392 bp。

2.2牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列分析

由圖2可知，對(duì)比分析牦牛、黃牛的Prdm9鋅指域序列發(fā)現(xiàn)，它們是含有5個(gè)連續(xù)的C2H2型鋅指，每個(gè)鋅指有21個(gè)氨基酸。還可以看出，與普通牛預(yù)測(cè)的鋅指結(jié)構(gòu)一樣，牦牛、黃牛的鋅指間是保守序列“TGEKPYV”，并且鋅指域從這個(gè)保守序列開(kāi)始。由表1還可以看出，牦牛、黃牛不僅在各自的5個(gè)鋅指間的氨基酸種類上存在差異，而且在整個(gè)鋅指域的4個(gè)鋅指中有6處氨基酸不同，這些差異的氨基酸在性質(zhì)上有很大不同。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指域的克隆與分析，發(fā)現(xiàn)了一些重要的氨基酸差異，為進(jìn)一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基礎(chǔ)，期望能夠?yàn)樯钊胙芯筷笈ｋs交雄性不育的分子機(jī)制提供參考資料。

參考文獻(xiàn)：

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[7]郭曉強(qiáng). PRDM9在哺乳動(dòng)物基因重組熱點(diǎn)中的作用[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2010，37（9）：929-931.

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2.2牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列分析

由圖2可知，對(duì)比分析牦牛、黃牛的Prdm9鋅指域序列發(fā)現(xiàn)，它們是含有5個(gè)連續(xù)的C2H2型鋅指，每個(gè)鋅指有21個(gè)氨基酸。還可以看出，與普通牛預(yù)測(cè)的鋅指結(jié)構(gòu)一樣，牦牛、黃牛的鋅指間是保守序列“TGEKPYV”，并且鋅指域從這個(gè)保守序列開(kāi)始。由表1還可以看出，牦牛、黃牛不僅在各自的5個(gè)鋅指間的氨基酸種類上存在差異，而且在整個(gè)鋅指域的4個(gè)鋅指中有6處氨基酸不同，這些差異的氨基酸在性質(zhì)上有很大不同。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指域的克隆與分析，發(fā)現(xiàn)了一些重要的氨基酸差異，為進(jìn)一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基礎(chǔ)，期望能夠?yàn)樯钊胙芯筷笈ｋs交雄性不育的分子機(jī)制提供參考資料。

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2.2牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指序列分析

由圖2可知，對(duì)比分析牦牛、黃牛的Prdm9鋅指域序列發(fā)現(xiàn)，它們是含有5個(gè)連續(xù)的C2H2型鋅指，每個(gè)鋅指有21個(gè)氨基酸。還可以看出，與普通牛預(yù)測(cè)的鋅指結(jié)構(gòu)一樣，牦牛、黃牛的鋅指間是保守序列“TGEKPYV”，并且鋅指域從這個(gè)保守序列開(kāi)始。由表1還可以看出，牦牛、黃牛不僅在各自的5個(gè)鋅指間的氨基酸種類上存在差異，而且在整個(gè)鋅指域的4個(gè)鋅指中有6處氨基酸不同，這些差異的氨基酸在性質(zhì)上有很大不同。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牦牛、黃牛Prdm9基因鋅指域的克隆與分析，發(fā)現(xiàn)了一些重要的氨基酸差異，為進(jìn)一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基礎(chǔ)，期望能夠?yàn)樯钊胙芯筷笈ｋs交雄性不育的分子機(jī)制提供參考資料。

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