王瑩　袁英

摘要：以含不與除草甘膦結合的突變型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因除草劑篩選標記的轉基因玉米為材料，通過葉片噴霧和葉片離體平板培養(yǎng)等試驗，建立快速非分子生物學抗除草劑轉基因玉米的鑒定方法。結果表明：用5 000 mg/L草甘膦葉片噴霧和用70 mg/L草甘膦葉片離體培養(yǎng)可快速準確地鑒定是否轉入除草劑基因。

關鍵詞：轉基因玉米；抗除草劑；草甘膦；鑒定方法

中圖分類號： S513.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0054-03

收稿日期：2013-08-15

基金項目：吉林省財政廳育種項目。

作者簡介：王瑩 （1982—），女，吉林長春人，碩士，講師，從事生物技術方向研究。Tel：（0431）84602461；E-mail：grammy1981@163.com。

通信作者：袁英，碩士，研究員，從事作物遺傳轉化研究。Tel：（0431）87063098；E-mail：32854085@qq.com。隨著轉基因作物商業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展，轉基因作物種植面積從1996年的170萬hm2增加到2012年的1.7億hm2，增長了99倍，這是前所未有的突破，其中抗除草劑作物種植面積最大[1]。在植物轉基因研究過程中，通常采用選擇性標記基因提高篩選效率，而除草劑基因是較常用的篩選標記基因，而5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因最常用。目前，國際上種植面積最大的抗除草劑轉基因玉米是轉EPSPS基因抗農達除草劑玉米[2]。近幾年，國內對抗除草劑轉基因玉米和抗除草劑篩選方法的研究也取得了很大的成功[3-11]。在轉基因研究和安全評價等過程中對轉基因植株的鑒定是必不可少的環(huán)節(jié)[12]，傳統(tǒng)上初步鑒定轉基因的方法是利用聚合酶鏈反應（PCR）鑒定目的基因DNA片段是否存在；但是PCR方法步驟繁瑣，做大量鑒定運用時有一定的局限性。利用篩選標記基因的農藝性狀，建立快速有效的非生物鑒定方法非常必要。本研究以抗除草劑轉基因玉米為研究材料，通過葉片噴霧、葉片離體培養(yǎng)方法建立抗除草劑轉基因玉米快速的鑒定方法，并探索出可以有效區(qū)分轉化和非轉化植株的篩選劑濃度。本研究建立的2種檢測方法既可用于轉基因植株當代的檢測篩選，又可用于轉基因后代植株的大規(guī)模檢測，大大減少了轉基因后代培養(yǎng)和進一步鑒定的工作量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料本研究所用的植株材料列于表1。

1.1.2試劑 41% 草甘膦異丙胺鹽水劑，由美國孟山都公司生產(chǎn)；6-芐氨基嘌呤 （6-BA），購于Sigma公司；國產(chǎn)瓊脂，由上海鼎國生物技術有限公司提供；EPSPS試紙條購于美國恩沃勞格公司。

1.1.3篩選培養(yǎng)基（液）的制備葉片噴霧液：50 mL滅菌水中加入1滴吐溫20，再加入不同濃度的除草劑。離體培養(yǎng)篩選培養(yǎng)基：0.7%瓊脂、1mg/L6-BA，煮沸使瓊脂溶解，冷卻

1.2方法

1.2.1葉片噴霧法篩選轉基因植株將0、1 000、3 000、5 000、7 000 mg/L草甘膦溶液均勻地噴灑在4葉期轉基因玉米和對照材料的葉片表面，直到葉片滴水為止，8～10 d后觀察。

1.2.2葉片離體培養(yǎng)法篩選轉基因植株剪取4葉期新長出5 d左右的新鮮綠色葉片（兩端均留有切口），長度約為1 cm，平貼在含有0、10、30、50、70、90 mg/L草甘膦固體培養(yǎng)基上（完全接觸培養(yǎng)基），25 ℃，16 h光照/8 h培養(yǎng)2～10 d，觀察。

1.2.3轉基因植株試紙條檢測試紙條快速檢測法：取稍許長度約為1 cm的葉片，放入1.5 mL 的離心管中，用研磨棒將葉片研碎，加入 0.5 mL 提取液，攪拌均勻，將試紙條按規(guī)定的方向插入混合液中，5 min后觀察結果。若試紙條出現(xiàn)2條帶，就表明該植株是陽性植株；若出現(xiàn)1條帶，說明是陰性植株；如果沒有帶，表明操作有誤[16]。

2結果與分析

2.1葉片噴灑除草劑法鑒定轉基因植株

植物葉片噴灑除草劑后，野生型植物葉片會發(fā)生枯萎，而抗除草劑轉基因植物則正常生長，說明該方法可用于鑒定含抗除草劑基因的轉基因植株。

含 CP4-EPSPS基因的玉米Mo17 EPS和吉853 EPS對除草劑草甘膦具有抗性。草甘膦噴灑的濃度梯度試驗結果表明，噴灑草甘膦即可在較短的時間內顯著區(qū)分玉米Mo17和吉853植株是否含有CP4-EPSPS基因。噴灑草甘膦8～ 10 d 后，當草甘膦濃度大于5 000 mg/L時，野生型玉米葉片植株整株枯萎死亡，有明顯中毒癥狀，而含CP4-EPSPS轉基因玉米沒有任何枯萎癥狀（圖1），表明用該濃度的除草劑草甘膦噴灑玉米葉片可快速區(qū)分轉基因玉米是否攜帶CP4-EPSPS 基因。并且含CP4-EPSPS轉基因玉米在高濃度草甘膦下依然能正常生長，表現(xiàn)出對草甘膦良好的耐受性。

2.2葉片離體培養(yǎng)法鑒定轉基因植株

用含除草劑的水溶液浸泡植株葉片，可簡便地鑒定轉基因植株。但由于植株葉片有較大的表面張力，影響了篩選劑與葉片的接觸。而在瓊脂培養(yǎng)基上，葉片可以完全接觸含有篩選劑的培養(yǎng)基，因此配置了含不同濃度除草劑的瓊脂培養(yǎng)基用于葉片抗性篩選劑的鑒定。由于培養(yǎng)基中不含糖分，可有效地避免離體葉片上滋生細菌和真菌。為了保持葉片的鮮綠，筆者還在培養(yǎng)基中加入了1 mg/L 6-BA。

隨著草甘膦濃度的增加，野生型植株葉片逐漸出現(xiàn)褐色現(xiàn)象。對于玉米材料吉853而言，當培養(yǎng)基中草甘膦濃度大于50 mg/L時，野生型葉片全部褐化；而對于Mo17而言，培養(yǎng)基中草甘膦濃度大于70mg/L時，野生型葉片大部分褐化。而轉基因材料植株葉片沒有明顯的褐化癥狀，保持鮮綠色（圖2）。因此，含有70 mg/L草甘膦的固體培養(yǎng)平板即可快速鑒定玉米植株是否攜帶CP4-EPSPS基因。

2.3轉基因植株分子檢測

使用試紙條檢測方法對玉米吉853和Mo17葉片進行檢測，結果如圖3所示。吉853 EPS和Mo17 EPS 等2種轉基因植株葉片進試紙條檢測均為陽性，吉853 CK和Mo17 CK等2種非轉基因植株葉片試紙條檢測均為陰性。這一結果與本研究檢測CP4-EPSPS基因的2種方法（葉片噴霧和葉片離體培養(yǎng)法）的結果一致。

3結論與討論

隨著轉基因玉米種植面積的日益擴大，建立標準的轉基因檢測方法十分必要，通常采取基因水平檢測法和蛋白水平檢測法[13]，但是都費時費力，在大規(guī)模、快速檢測時有一定的局限性。本研究以抗除草劑轉基因玉米為研究材料，建立葉片噴霧法和葉片離體培養(yǎng)法2種快速的鑒定抗除草劑轉基因玉米方法。與傳統(tǒng)的分子檢測方法相比，這2種方法方便易行、成本低、誤差小，可明顯地減少轉基因植株后續(xù)檢測的工作量，在植物轉基因領域及轉基因安全檢測工作中具有很好的應用前景。

葉片噴霧法及離體葉片培養(yǎng)法既可用于轉基因植株當代的檢測，又可用于轉基因植株后代的檢測。草甘膦是目前世界上使用量最大的農藥，抗草甘膦轉基因作物是世界上種植面積最廣的轉基因作物[14]。5 000 mg/L草甘膦溶液葉片噴霧可以快速殺死非轉基因玉米植株，而CP4-EPSPS轉基因玉米在草甘膦濃度達到7 000 mg/L時仍能正常生長；采用離體葉片培養(yǎng)法，70 mg/L草甘膦濃度可以有效將CP4-EPSPS轉基因玉米與非轉基因玉米區(qū)分開來。草甘膦藥效快，土壤中可快速降解，不僅廣泛用于農業(yè)生產(chǎn)，同時在植物轉基因研究中也十分重要。采用合適濃度直接噴霧或者葉片離體培養(yǎng)可以有效區(qū)分轉化和非轉化植株。由于除草劑的來源和不同作物葉片對除草劑的吸收不同，采用葉片噴霧法檢測抗除草劑轉基因水稻和大豆時分別需要300、135 mg/L草銨膦[12]。借鑒離體葉片鑒定轉基因植物水稻的經(jīng)驗[15]，培養(yǎng)基中含有70 mg/L草甘膦可有效區(qū)分是否為抗除草劑轉基因玉米。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效鑒定轉基因材料，也說明EPSPS基因在玉米中表達后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效地鑒定轉基因材料，也說明CP4-EPSPS這個基因在玉米中表達后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。對采用這2種檢測方法獲得的轉基因植株采用試紙條檢測，結果100%吻合。

本研究表明，經(jīng)過適宜篩選壓力可有效區(qū)分轉基因植株和非轉基因，而且方法簡單、快速、準確，特別適合于轉基因后代植株的大規(guī)模篩選。該方法也有不足之處，如較老葉片對篩選劑反應不靈敏，易造成結果誤判，應選取幼嫩葉片進行試驗。在實際應用中，還應根據(jù)基因來源、篩選劑來源及植物材料不同探索適合的濃度。該方法對以除草劑為篩選標記的轉基因檢測是有效可行的，尤其在大規(guī)模的轉基因后代檢測中具有一定的實用價值，為今后轉基因作物育種篩選提供了技術支撐。

參考文獻：

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[14]蘇少泉. 草甘膦述評[J]. 農藥，2005，44（4）：145-149.

[15]劉巧泉，陳秀花，王興穩(wěn)，等. 一種快速檢測轉基因水稻中潮霉素抗性的簡易方法[J]. 農業(yè)生物技術學報，2001，9（3）：264，268.

[16]盧濤，李紅艷，章潔瓊，等. 以bar基因為篩選標記轉基因大豆的獲得及鑒定[J]. 大豆科學，2011，30（6）：895-900.

2.3轉基因植株分子檢測

使用試紙條檢測方法對玉米吉853和Mo17葉片進行檢測，結果如圖3所示。吉853 EPS和Mo17 EPS 等2種轉基因植株葉片進試紙條檢測均為陽性，吉853 CK和Mo17 CK等2種非轉基因植株葉片試紙條檢測均為陰性。這一結果與本研究檢測CP4-EPSPS基因的2種方法（葉片噴霧和葉片離體培養(yǎng)法）的結果一致。

3結論與討論

隨著轉基因玉米種植面積的日益擴大，建立標準的轉基因檢測方法十分必要，通常采取基因水平檢測法和蛋白水平檢測法[13]，但是都費時費力，在大規(guī)模、快速檢測時有一定的局限性。本研究以抗除草劑轉基因玉米為研究材料，建立葉片噴霧法和葉片離體培養(yǎng)法2種快速的鑒定抗除草劑轉基因玉米方法。與傳統(tǒng)的分子檢測方法相比，這2種方法方便易行、成本低、誤差小，可明顯地減少轉基因植株后續(xù)檢測的工作量，在植物轉基因領域及轉基因安全檢測工作中具有很好的應用前景。

葉片噴霧法及離體葉片培養(yǎng)法既可用于轉基因植株當代的檢測，又可用于轉基因植株后代的檢測。草甘膦是目前世界上使用量最大的農藥，抗草甘膦轉基因作物是世界上種植面積最廣的轉基因作物[14]。5 000 mg/L草甘膦溶液葉片噴霧可以快速殺死非轉基因玉米植株，而CP4-EPSPS轉基因玉米在草甘膦濃度達到7 000 mg/L時仍能正常生長；采用離體葉片培養(yǎng)法，70 mg/L草甘膦濃度可以有效將CP4-EPSPS轉基因玉米與非轉基因玉米區(qū)分開來。草甘膦藥效快，土壤中可快速降解，不僅廣泛用于農業(yè)生產(chǎn)，同時在植物轉基因研究中也十分重要。采用合適濃度直接噴霧或者葉片離體培養(yǎng)可以有效區(qū)分轉化和非轉化植株。由于除草劑的來源和不同作物葉片對除草劑的吸收不同，采用葉片噴霧法檢測抗除草劑轉基因水稻和大豆時分別需要300、135 mg/L草銨膦[12]。借鑒離體葉片鑒定轉基因植物水稻的經(jīng)驗[15]，培養(yǎng)基中含有70 mg/L草甘膦可有效區(qū)分是否為抗除草劑轉基因玉米。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效鑒定轉基因材料，也說明EPSPS基因在玉米中表達后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效地鑒定轉基因材料，也說明CP4-EPSPS這個基因在玉米中表達后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。對采用這2種檢測方法獲得的轉基因植株采用試紙條檢測，結果100%吻合。

本研究表明，經(jīng)過適宜篩選壓力可有效區(qū)分轉基因植株和非轉基因，而且方法簡單、快速、準確，特別適合于轉基因后代植株的大規(guī)模篩選。該方法也有不足之處，如較老葉片對篩選劑反應不靈敏，易造成結果誤判，應選取幼嫩葉片進行試驗。在實際應用中，還應根據(jù)基因來源、篩選劑來源及植物材料不同探索適合的濃度。該方法對以除草劑為篩選標記的轉基因檢測是有效可行的，尤其在大規(guī)模的轉基因后代檢測中具有一定的實用價值，為今后轉基因作物育種篩選提供了技術支撐。

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2.3轉基因植株分子檢測

使用試紙條檢測方法對玉米吉853和Mo17葉片進行檢測，結果如圖3所示。吉853 EPS和Mo17 EPS 等2種轉基因植株葉片進試紙條檢測均為陽性，吉853 CK和Mo17 CK等2種非轉基因植株葉片試紙條檢測均為陰性。這一結果與本研究檢測CP4-EPSPS基因的2種方法（葉片噴霧和葉片離體培養(yǎng)法）的結果一致。

3結論與討論

隨著轉基因玉米種植面積的日益擴大，建立標準的轉基因檢測方法十分必要，通常采取基因水平檢測法和蛋白水平檢測法[13]，但是都費時費力，在大規(guī)模、快速檢測時有一定的局限性。本研究以抗除草劑轉基因玉米為研究材料，建立葉片噴霧法和葉片離體培養(yǎng)法2種快速的鑒定抗除草劑轉基因玉米方法。與傳統(tǒng)的分子檢測方法相比，這2種方法方便易行、成本低、誤差小，可明顯地減少轉基因植株后續(xù)檢測的工作量，在植物轉基因領域及轉基因安全檢測工作中具有很好的應用前景。

葉片噴霧法及離體葉片培養(yǎng)法既可用于轉基因植株當代的檢測，又可用于轉基因植株后代的檢測。草甘膦是目前世界上使用量最大的農藥，抗草甘膦轉基因作物是世界上種植面積最廣的轉基因作物[14]。5 000 mg/L草甘膦溶液葉片噴霧可以快速殺死非轉基因玉米植株，而CP4-EPSPS轉基因玉米在草甘膦濃度達到7 000 mg/L時仍能正常生長；采用離體葉片培養(yǎng)法，70 mg/L草甘膦濃度可以有效將CP4-EPSPS轉基因玉米與非轉基因玉米區(qū)分開來。草甘膦藥效快，土壤中可快速降解，不僅廣泛用于農業(yè)生產(chǎn)，同時在植物轉基因研究中也十分重要。采用合適濃度直接噴霧或者葉片離體培養(yǎng)可以有效區(qū)分轉化和非轉化植株。由于除草劑的來源和不同作物葉片對除草劑的吸收不同，采用葉片噴霧法檢測抗除草劑轉基因水稻和大豆時分別需要300、135 mg/L草銨膦[12]。借鑒離體葉片鑒定轉基因植物水稻的經(jīng)驗[15]，培養(yǎng)基中含有70 mg/L草甘膦可有效區(qū)分是否為抗除草劑轉基因玉米。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效鑒定轉基因材料，也說明EPSPS基因在玉米中表達后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。這些不僅說明葉片噴霧法及葉片離體培養(yǎng)法可有效地鑒定轉基因材料，也說明CP4-EPSPS這個基因在玉米中表達后的確能夠提高玉米對草甘膦的抗性。對采用這2種檢測方法獲得的轉基因植株采用試紙條檢測，結果100%吻合。

本研究表明，經(jīng)過適宜篩選壓力可有效區(qū)分轉基因植株和非轉基因，而且方法簡單、快速、準確，特別適合于轉基因后代植株的大規(guī)模篩選。該方法也有不足之處，如較老葉片對篩選劑反應不靈敏，易造成結果誤判，應選取幼嫩葉片進行試驗。在實際應用中，還應根據(jù)基因來源、篩選劑來源及植物材料不同探索適合的濃度。該方法對以除草劑為篩選標記的轉基因檢測是有效可行的，尤其在大規(guī)模的轉基因后代檢測中具有一定的實用價值，為今后轉基因作物育種篩選提供了技術支撐。

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