蔣晶等

摘要：以茄子抗青枯病自交系E-31為材料，在4葉期接種青枯病菌，48 h后采集葉片提取RNA，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建茄子uncut型cDNA文庫。經(jīng)檢測，本研究獲得的茄子葉片cDNA文庫滴度達(dá)到0.01億CFU/mL，總庫容量為0.15億CFU，平均插入片段長度在1.2 kb以上，重組率為100%。說明構(gòu)建的文庫能達(dá)到所需要的標(biāo)準(zhǔn)，可用于分離茄子的功能基因。

關(guān)鍵詞：uncut型cDNA文庫；Gateway技術(shù)；茄子；青枯病

中圖分類號： S641.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）04-0022-03

收稿日期：2013-08-31

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：30972005）；廣東省自然科學(xué)基金（編號：9151064201000063）；廣東省自然科學(xué)基金研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號：S2011030001410）；廣東省教育廳華南園藝作物種質(zhì)資源利用與改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號：KBL11008）。

作者簡介：蔣晶（1990—），女，湖南寧鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事茄子抗青枯病基因功能鑒定。E-mail：92157135@qq.com。

通信作者：曹必好，教授。Tel：（020）85280228；E-mail：caobh01@163.com。茄子（Solanum melongena L.）是一種在亞洲、地中海、中歐及東南歐地區(qū)廣泛栽培的蔬菜作物[1]。在高溫高濕的季節(jié)，茄子易受青枯病害的侵襲，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可造成產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅下降，已成為影響茄子高產(chǎn)的主要因素[2]。目前，有關(guān)茄子抗青枯病的分子育種進(jìn)展緩慢，茄子對青枯病的抗性分子機(jī)制仍然不清楚，若要解析這些機(jī)理，必須分離出相關(guān)抗性基因以及互作基因，并對它們進(jìn)行功能鑒定，這對開展持久、廣譜的茄子抗病分子育種具有重要的意義[3]。構(gòu)建一個完整的cDNA文庫是開展分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是克隆新基因和研究基因功能的有效策略之一[4-6]。未剪切cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是采用Invitrogen專利的Gateway位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，將mRNA轉(zhuǎn)變成兩頭帶有attB重組位點(diǎn)的雙鏈cDNA，通過定點(diǎn)重組，cDNA被定向克隆到Gateway的供體載體，從而產(chǎn)生初級文庫，該初級文庫可以通過和各種Gateway目的載體進(jìn)行Gateway LR重組，構(gòu)建成為不同的表達(dá)文庫[7-9]。未剪切cDNA文庫的全長比例和庫容量等均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)cDNA 文庫。目前有關(guān)茄子cDNA 文庫的構(gòu)建報(bào)道不多，本研究應(yīng)用 Gateway 技術(shù)構(gòu)建高質(zhì)量的茄子未剪切型 cDNA 文庫，旨在為未來分離有用的功能基因打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料本試驗(yàn)材料為茄子高抗自交系E-31，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)曹必好教授提供。

1.1.2試劑pDONR222，CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Ki，TRIzol Reagent，F(xiàn)astTrack MAG mRNA isolation Kit，SuperScript Ⅲ，Platinum Taq DNA Polymerase均購自 Invitrogen 公司。

1.2方法

1.2.1青枯病接種青枯病菌為生理小種1，從田間發(fā)病植株中分離得到。青枯病菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基為肉汁胨培養(yǎng)基（基本培養(yǎng)基成分：牛肉浸膏3 g、蛋白胨5～10 g、蔗糖 10 g、瓊脂17～20 g、蒸餾水1 000 mL、 pH值7.0），在恒溫 30 ℃ 下增殖培養(yǎng)24 h。分離時(shí)在基本培養(yǎng)基上加入005%氯化三苯四氮唑（TZC），挑起白色流動性強(qiáng)菌落，在未加瓊脂的上述培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。將增殖培養(yǎng)的病原菌菌液加無菌水稀釋。用紫外分光光度計(jì)在波長650 nm處測定病菌濃度，將菌液濃度調(diào)制成1億CFU/mL懸濁液。在幼苗為4葉期時(shí)，采用傷根-蘸根法人工接種，菌液濃度為1億CFU/mL浸根，時(shí)間為20 min。把幼苗定植于營養(yǎng)缽中，放入恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)48 h，采集葉片提取RNA。

1.2.2總RNA的提取及mRNA的分離取1 g組織樣品，采利用Trizol提取樣品的總RNA。取500 μg提取的總RNA，冰上融化放置，加DEPC水置總體積500 μL，參照FastTrack MAG mRNA isolation Kit說明書進(jìn)行mRNA的分離純化。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA及mRNA的純度和質(zhì)量。

1.2.3cDNA的合成（1）cDNA第一鏈的合成參照CloneMiner說明書進(jìn)行。將2 μg mRNA溶于10 μL DEPC水中，加入 biotin-attB2-Oligo（dT） Primer （30 pmol） 1 μL混勻，65 ℃ 5 min，降溫到45 ℃孵育2 min，加入5 × First Strand Buffer 4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，45 ℃ 孵育2 min；最后加入200 U/μL SuperScript Ⅱ RT 2 μL 混勻，置于PCR儀上反應(yīng)45 ℃ 20 min、50 ℃ 20 min、55 ℃ 20 min。（2）cDNA第二鏈的合成。在上述溶液中加入DEPC水 91 μL，5×Second Strand Buffer 30 μL，dNTPs （10 mmol/L）3 μL，大腸肝菌DNA Ligase（10 U/μL） 1 μL，大腸桿菌DNA PolymeraseⅠ（10 U/μL） 4 μL 大腸桿菌RNaseH（2 U/μL）1 μL混勻，16 ℃條件下反應(yīng)2 h；最后加入T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃，反應(yīng) 5 min。將獲得的雙鏈cDNA純化，溶解于DEPC水中。

1.2.4cDNA與attB1重組接頭連接將下列組分加入到 6 μL 雙鏈cDNA中，使得cDNA雙鏈加入attB1接頭：5×Adapter Buffer 10 μL，attB1 Adapter （1 μg/μL） 10 μL，0.1 mol/L DTT 7 μL，T4 DNA Ligase（1 U/μL）5 μL，DEPC水12 μL混勻后 16 ℃ 保溫20 h。

1.2.5BP重組反應(yīng)及文庫的構(gòu)建取cDNA 13 μL于 20 μL 反應(yīng)體系[pDONR222 （250 ng/μL）2 μL，BP Clonase Ⅱ enzyme mix 5 μL]混勻后置于25 ℃下反應(yīng)20 h，進(jìn)行BP重組。利用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌置于37 ℃、225～250 r/min搖床上培養(yǎng) 1 h，加入甘油至終濃度20%存于-80 ℃，即得文庫菌液。

1.2.6cDNA文庫質(zhì)量鑒定

1.2.6.1庫容量的鑒定取轉(zhuǎn)化后細(xì)菌原液10 μL稀釋 1 000 倍后，從中取出50 μL涂布LB平板（卡那霉素，工作濃度是50 μg/mL）上，第2天計(jì)數(shù)。文庫菌液的單位菌落數(shù)（CFU/mL）=平板上的克隆數(shù)/50 μL×1 000倍×1 000 μL，文庫總菌落數(shù)（CFU）=文庫菌液的單位菌落數(shù)（CFU/mL）×文庫菌液總體積（mL）。

1.2.6.2重組率和插入片段長度鑒定隨機(jī)挑取24個克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，在Microtube中配制總體積為20 μL的反應(yīng)液[ddH2O 16.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，M13F（20 μmol/L）0.5 μL，M13R（20 μmol/L）0.5 μL，DNA Polymerase（5 U/μL）0.3 μL]，放置在Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃保溫5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。M13F：TGTAAAACGACGGCAGT；M13R：CAGGAAACAGCTATGACC。

2結(jié)果與分析

2.1RNA及mRNA質(zhì)量

提取的總 RNA 在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從電泳結(jié)果中可看到 28S、18S、5S等3條清晰的電泳條帶（圖1），28S與18S的亮度比接近2 ∶1，D260 nm/D280 nm及D260 nm/D230 nm的值在1.9～2.0之間，表明該樣品總RNA基本上沒有降解，完整性良好，無蛋白質(zhì)和多糖的污染，可以作為起始樣品用于文庫構(gòu)建。mRNA電泳結(jié)果為一片模糊的拖帶（圖1），這是由于mRNA的長度不一所造成的，且拖帶最亮部分的范圍在較大的分子量范圍內(nèi)（大于500 bp），由此可以認(rèn)定mRNA未出現(xiàn)降解，完整性較好。

2.2文庫質(zhì)量鑒定

2.2.1總克隆數(shù)CFU的鑒定LB平板37 ℃ 過夜培養(yǎng)，在平板上長出75個單一克隆（圖2）。根據(jù)公式得到其單位菌落數(shù)（平板稀釋度1 ∶1 000）=75/50 μL×1 000×1 000=0015億CFU/mL，文庫總庫容量=0.015億CFU/mL×10 mL=0.15億CFU。

2.2.2插入片段大小及重組率鑒定隨機(jī)挑取的24個克隆PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，平均插入片段長度在1.2 kb以上，重組率為100%（圖3）。

按照CloneMiner cDNA Library Construction Kit的要求，一個高質(zhì)量文庫的滴度應(yīng)大于0.01億CFU/mL，文庫總?cè)萘看笥?00萬CFU，陽性克隆率大于95%，平均插入片段大于或等于1.5 kb。由此可見，本研究構(gòu)建的茄子葉片cDNA文庫是一個質(zhì)量較高的文庫。

3結(jié)論與討論

植物組織中的RNA含量較低，且離體植物組織的 RNA 降解速度很快。RNA提取是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，其困難首先是RNA非常容易降解而RNase又無處不在，并且非常穩(wěn)定；其次是組織中的次生物質(zhì)如酚類、多糖等也會影響RNA的質(zhì)量[10-11]。

在本試驗(yàn)中cDNA的分級分離是一個不可忽視的環(huán)節(jié)。用凝膠柱除去已消化的接頭碎片和小片段的cDNA分子，收集片段大小合適的cDNA樣品。這樣保證了文庫中cDNA具有較大的分子，對篩選有重要意義，可明顯減少后期篩選的工作量。

未剪切cDNA文庫構(gòu)建的基本原理是采用Invitrogen專利的Gateway位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于無需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶，基本克服了常規(guī)cDNA文庫構(gòu)建方法中存在的被限制性內(nèi)切酶切開而無法得到完整的基因序列，以及連接效率不高的缺陷[12]。一個高質(zhì)量cDNA文庫的關(guān)鍵就是要保證文庫的完整性與覆蓋度[13]。本試驗(yàn)所構(gòu)建的茄子cDNA文庫，插入片段絕大多數(shù)在1.2 kb以上，文庫總?cè)萘窟_(dá)到0.15億CFU，重組率達(dá)到100%，而一般的普通的cDNA文庫滴度只需要0.01億CFU/mL，重組率達(dá)到80%以上，插入片段的大小達(dá)到500 bp以上的標(biāo)準(zhǔn)，由此可見，本研究所構(gòu)建的cDNA是高質(zhì)量的cDNA文庫。

cDNA便于克隆和大量表達(dá)，它不像基因組含有內(nèi)含子而難以表達(dá)，因此，可以從cDNA文庫中篩選到所需要的目的基因，并且可直接用于該目的基因的表達(dá)[14]。cDNA文庫構(gòu)建目前己廣泛應(yīng)用于不同發(fā)育階段基因表達(dá)的變化、某特定發(fā)育期基因表達(dá)的分子機(jī)制、克隆新型細(xì)胞因子、分離新的組織特異基因等方面的研究[15-21]。隨著cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)的日益提高和普及，cDNA文庫已成為克隆相關(guān)基因的一種首選方法，在基因操作過程中具有十分廣泛的基礎(chǔ)性作用，近年來，構(gòu)建cDNA文庫已在植物抗病蟲、抗逆境分子機(jī)理等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[22-26]。

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