王飛　張麗

摘要：采用超聲波破碎多食鞘氨醇桿菌細(xì)胞壁的方法提取雌二醇降解酶，通過(guò)單因素條件研究確定各因素對(duì)超聲波破碎影響的高低，依據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原則對(duì)破碎條件進(jìn)行響應(yīng)面回歸模型分析（RSA）。研究得到最佳條件為：菌體濃度188 mg/mL，破碎功率400 W，總破碎時(shí)間29 min（超聲3 s，間隔5 s），認(rèn)為破碎功率對(duì)超聲波破碎的影響最大。預(yù)測(cè)破碎后得到的粗酶液總酶活力為1.484 U，實(shí)際測(cè)得的粗酶液酶活力為1.477 U。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為：采用超聲波破碎方法可以較好地提取氨肽酶，運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波破碎條件是可行的。

關(guān)鍵詞：ED4菌株；超聲波破碎；E2降解酶

中圖分類號(hào)：Q814.1；X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0310-04

收稿日期：2013-08-23

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：SBK201022464）。

作者簡(jiǎn)介：王飛（1988—），女，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：wang576180559@126.com。

通信作者：張麗，女，碩士，副教授，研究方向?yàn)樯锘?。E-mail：njust_zhangli@163.com。近年來(lái)，甾體雌激素因其對(duì)生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的種種不利影響而引起人們的廣泛關(guān)注[1-3]。甾體雌激素是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)（endocrine-disrupting compounds，EDCs），是指能夠進(jìn)入生物體內(nèi)的外源性物質(zhì)，可干擾生物體內(nèi)天然激素的產(chǎn)生、釋放、代謝、交互作用，從而對(duì)生物體正常的體內(nèi)激素平衡、代謝生長(zhǎng)和行為產(chǎn)生干擾作用[4]。17β-雌二醇（E2）被認(rèn)為是最具潛在影響、作用最強(qiáng)烈且在水環(huán)境中普遍存在的一種甾體雌激素，當(dāng)其質(zhì)量濃度低至ng/L級(jí)時(shí)仍可對(duì)水生生物繁殖、生態(tài)安全乃至人類健康造成極大的潛在威脅[5-6]。目前雌激素污染的生物修復(fù)主要通過(guò)從被污染的土壤與水質(zhì)中分離篩選降解菌，再將其用于雌激素的生物降解、修復(fù)[7-12]。本研究采用超聲波破碎E2降解菌細(xì)胞壁的方法提取E2降解酶，通過(guò)單因素條件研究、響應(yīng)面分析優(yōu)化超聲波破碎的最佳條件，旨在為E2降解酶的研究和E2降解途徑的建立奠定初步的研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株：多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivolum）ED4，能高效降解17β-雌二醇，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離獲得。

試驗(yàn)藥品：17β-雌二醇（17β-estradiol，E2），純度>98%，購(gòu)自美國(guó)Sigma。

試驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，汕頭市科毅儀器設(shè)備有限公司；HC-3518高速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；DSX-280A手提式滅菌鍋，上海申騁儀器科技有限公司；752N分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌體制備從4 ℃冰箱中保存的LB斜面上挑取ED4菌株，連續(xù)活化3代，按2%接種量，在30 ℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)取出，離心收集菌體沉淀（4 ℃、5 000 r/min條件下離心20 min）；用pH值為7的磷酸緩沖溶液清洗、離心，反復(fù)洗滌后用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基將菌液稀釋到D600 nm為約0.5后，便制成菌懸液。

1.2.2粗酶液的制備將ED4菌種進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)72 h后，冰浴條件下用超聲波破碎細(xì)胞，300 W破碎4 s，間隔8 s，共破碎30 min；于10 000 r/min、4 ℃條件下高速離心30 min，收集上清液即為粗酶液。

1.2.317β-雌二醇降解酶活力的測(cè)定方法先向20 mL試管中加入9 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（含10 mg/L 17β-雌二醇），再加入1mL粗酶液，30 ℃水浴中反應(yīng)1 h后加入05 mL 1 mol/L的HCl溶液終止酶反應(yīng)。每個(gè)處理重復(fù)2次。在一定溫度和pH值條件下，1 min內(nèi)減少1 μg 17β-雌二醇所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，用U表示[13]。

1.2.4超聲波破碎條件的確定首先根據(jù)單因素試驗(yàn)確定菌體濃度、破碎功率、破碎時(shí)間3個(gè)條件對(duì)超聲波破碎的影響，然后按Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以菌體濃度、破碎功率、破碎時(shí)間為響應(yīng)變量，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定上下水平后，用Design-Expert 8.0.7.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。破碎中用冰水浴冷卻樣品。

2結(jié)果與分析

2.1單因素超聲波破碎條件

2.1.1菌體濃度對(duì)超聲波破碎提取17β-雌二醇降解酶的影響在超聲波破碎功率為300 W、超聲破碎總時(shí)間為 26 min （工作時(shí)間4 s，間隔時(shí)間6 s）的條件下，配置50～350 mg/mL 不同濃度的ED4降解菌菌體懸液進(jìn)行細(xì)胞破碎。由圖1可以看出，當(dāng)菌體濃度為200 mg/mL時(shí)，17β-雌二醇降解酶的酶活力最高，但是隨著破碎體系中菌體濃度逐漸升高，酶活力隨之降低，這可能是當(dāng)菌體濃度過(guò)高時(shí)，超聲波破碎難以形成空穴效應(yīng)，產(chǎn)生的多余熱量降低了破碎效率并破壞了降解酶活性。

2.1.2破碎功率對(duì)超聲波破碎提取17β-雌二醇降解酶的影響當(dāng)菌體懸液濃度為200 mg/mL時(shí)，在100～600 W的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)超聲破碎功率，破碎26 min（工作4 s，間隔6 s）。圖2結(jié)果表明，當(dāng)破碎功率為300 W時(shí)，17β-雌二醇降解酶的酶活力最高；隨著破碎功率的不斷增加，降解酶活力逐漸下降；破碎功率過(guò)低時(shí)，降解酶釋放不完全而使酶活力較低；破碎功率超過(guò)最佳值時(shí)，由于超聲波空化現(xiàn)象而導(dǎo)致熱能增加，從而破壞了酶活性。

2.1.3破碎時(shí)間對(duì)超聲波破碎提取17β-雌二醇的影響設(shè)菌體懸液濃度為200 mg/mL，超聲破碎功率為300 W，破碎時(shí)間分別為5、12、19、26、33、40、47 min（工作4 s，間隔6 s）。圖3結(jié)果表明，在菌體濃度和超聲波破碎功率保持不變的前提下，17β-雌二醇降解酶的酶活力在破碎時(shí)間為26 min時(shí)達(dá)到最大值；隨著破碎時(shí)間的增加，降解酶活力呈下降趨勢(shì)。可能隨著時(shí)間的增加，超聲產(chǎn)生的熱量也逐漸增多，從而導(dǎo)致酶活力下降。endprint

2.2超聲波提取17β-雌二醇降解酶條件的優(yōu)化

以破碎功率、菌體濃度、破碎時(shí)間為響應(yīng)變量，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定上下水平后，按Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行優(yōu)化分析。各試驗(yàn)組的因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)分組及結(jié)果見(jiàn)表2。

3結(jié)論

本試驗(yàn)研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超聲破碎的優(yōu)化條件。首先利用單因素試驗(yàn)確定了破碎時(shí)間、破碎功率、菌體濃度等最佳破碎條件，然后用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法確定了影響因子的取值。優(yōu)化后的破碎條件為破碎功率400 W、破碎時(shí)間29 min、菌體濃度188 mg/mL。在此破碎條件下，降解酶酶活力為1.477 U，與預(yù)測(cè)值擬合良好，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際破碎情況。

參考文獻(xiàn)：

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2.2超聲波提取17β-雌二醇降解酶條件的優(yōu)化

以破碎功率、菌體濃度、破碎時(shí)間為響應(yīng)變量，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定上下水平后，按Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行優(yōu)化分析。各試驗(yàn)組的因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)分組及結(jié)果見(jiàn)表2。

3結(jié)論

本試驗(yàn)研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超聲破碎的優(yōu)化條件。首先利用單因素試驗(yàn)確定了破碎時(shí)間、破碎功率、菌體濃度等最佳破碎條件，然后用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法確定了影響因子的取值。優(yōu)化后的破碎條件為破碎功率400 W、破碎時(shí)間29 min、菌體濃度188 mg/mL。在此破碎條件下，降解酶酶活力為1.477 U，與預(yù)測(cè)值擬合良好，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際破碎情況。

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2.2超聲波提取17β-雌二醇降解酶條件的優(yōu)化

以破碎功率、菌體濃度、破碎時(shí)間為響應(yīng)變量，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定上下水平后，按Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)并進(jìn)行優(yōu)化分析。各試驗(yàn)組的因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)分組及結(jié)果見(jiàn)表2。

3結(jié)論

本試驗(yàn)研究了1株17β-雌二醇高效降解菌的超聲破碎的優(yōu)化條件。首先利用單因素試驗(yàn)確定了破碎時(shí)間、破碎功率、菌體濃度等最佳破碎條件，然后用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法確定了影響因子的取值。優(yōu)化后的破碎條件為破碎功率400 W、破碎時(shí)間29 min、菌體濃度188 mg/mL。在此破碎條件下，降解酶酶活力為1.477 U，與預(yù)測(cè)值擬合良好，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際破碎情況。

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