吉富羅非魚源無乳鏈球菌Sip-GAPDH融合基因的構(gòu)建及其原核表達(dá)

王蓓 李桂歡 魯義善 湯菊芬 黃郁蔥吳灶和 簡(jiǎn)紀(jì)常

（1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；4.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225）

羅非魚，又被稱為“白色三文魚”，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的21世紀(jì)最有發(fā)展前景的淡水養(yǎng)殖品種［1，2]。然而隨著高密度養(yǎng)殖和環(huán)境日益惡化，病害日趨嚴(yán)重，造成的損失逐年增加。從2009年至今，羅非魚鏈球菌病在我國(guó)羅非魚多個(gè)主養(yǎng)地區(qū)泛濫，發(fā)病及死亡率高，并由傳統(tǒng)的高溫時(shí)節(jié)發(fā)病演變?yōu)橼呄蛴谌甏蟛糠謺r(shí)間均可發(fā)生，發(fā)病率和死亡率直線上升（部分地區(qū)可高達(dá)90%）［3]。

為了預(yù)防羅非魚鏈球菌病，人們不斷地對(duì)鏈球菌病疫苗進(jìn)行研究和探索。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過人工合成或重疊延伸等方法可將幾個(gè)不同的基因片段相互拼接起來，構(gòu)成不同蛋白質(zhì)的融合體，同時(shí)展現(xiàn)不同來源蛋白質(zhì)的活性和功能，甚至可以獲得協(xié)同效應(yīng)［4]。表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein，Sip）是B群鏈球菌（Group BStreptococcus，GBS）的一種表面蛋白，在GBS 多種血清型的菌株中均有表達(dá)，目前該蛋白已在人、小鼠、奶牛及羅非魚中證實(shí)了其具有良好的免疫原性［5-7]。病原微生物中的某些生理代謝作用酶在近年來被作為疫苗和藥物的研究靶分子對(duì)象［8]，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）便是糖酵解過程中的一種關(guān)鍵代謝酶，在多種病原體中已經(jīng)進(jìn)行了其作為保護(hù)性抗原的研究并取得了良好的效果［9，10]。

本研究利用重疊延伸PCR技術(shù)將羅非魚源無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）Sip基因和GAPDH基因通過特定的Linker序列進(jìn)行連接，構(gòu)建無乳鏈球菌Sip-GAPDH融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，旨在為研制具有良好保護(hù)率的鏈球菌亞單位疫苗奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 羅非魚源無乳鏈球菌（S. agalactiae）強(qiáng)毒株ZQ0910由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 試劑 大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）與pET-32a（+）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司（日本）。表達(dá)載體pET-32（a）購(gòu)自Novagen公司（德國(guó)）。限制性內(nèi)切酶BamH I、SalI、T4 DNA連接酶和Prime STARTMHS DNA polymerase均購(gòu)自TaKaRa公司（日本）。小鼠抗His-Tag單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG和顯色底物DAB均為Invitrogen產(chǎn)品（美國(guó)）。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品（中國(guó)）。HisTrap HP為GE公司產(chǎn)品（美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取及Sip、GAPDH基因的擴(kuò)增 按照天根生化科技（北京）有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取無乳鏈球菌（S.agalactiae）基因組DNA，根據(jù)GenBank上已登錄的Sip、GAPDH基因序列（EIM 69670.1、EIM71266.1）設(shè)計(jì)特異性引物S1/S2和G1/G2，分別引入酶切位點(diǎn)BamH I與SalI，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，60℃/57℃（Sip/GAPDH）30 s，72℃ 90 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后切膠回收，然后克隆入pMD18-T載體，菌落PCR鑒定后將陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 Sip、GAPDH基因的擴(kuò)增引物

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增 根據(jù)測(cè)序所得到的Sip，GAPDH基因序列，應(yīng)用Primer5.0軟件，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物P1/P2、P3/P4分別用于擴(kuò)增準(zhǔn)備進(jìn)行融合的基因，該引物中引入了柔韌性較好的（Gly4Ser）3氨基酸多肽作為linker序列（表2斜體部分）鏈接兩個(gè)基因，并在P1/P4引物中分別引入酶切位點(diǎn)BamH I與SalI，由生工生物工程（上海）股份有限公司（表2）。以pMD18-Sip和pMD18-GAPHD質(zhì)粒為模板，采用引物P1/P2，P3/P4分別擴(kuò)增Sip和GAPDH基因。PCR體系為：模板2 μL，上下游引物各 1 μL，dNTP Mixture 4 μL，Prime STARTmHS DNA polymerase 0.5 μL，5×Prime STARTMBuffer（Mg+plus）10 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR反應(yīng)條件同1.2.1。

1.2.3Sip與GAPDH基因融合 取Sip與GAPDH回收產(chǎn)物各2 μL混合作為模板，PCR體系為：Sip+GAPDH2 μL+2 μL，10×LA Buffer 5 μL，LA酶1 μL，dNTP Mixture 4 μL，ddH2O 33 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 3 min，10個(gè)循環(huán)；最后向PCR管中補(bǔ)加引物P1、P4和LA酶各1 μL，繼續(xù)進(jìn)行PCR循環(huán)25個(gè)，然后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后克隆入pMD18-T載體構(gòu)建，菌落PCR鑒定后將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMD18-Sip-GAPDH送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表2 Sip-GAPDH融合基因擴(kuò)增引物

1.2.4 融合基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建 將pMD18-Sip-GAPDH質(zhì)粒和pET-32a（+）質(zhì)粒分別采用限制性內(nèi)切酶BamH I和SalI雙酶切，用T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp＋（100 μg/mL）的LB平板，挑取單個(gè)菌落，接種于1mL LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。PCR菌落及測(cè)序鑒定正確后，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行PCR菌落和測(cè)序檢測(cè)。將測(cè)序結(jié)果正確的菌株液以1∶100的比例接種于含Amp＋（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的濃度分別為0.02、0.06、0.1、0.4、0.7和1.0 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為0、1、2、3、4和5 h，誘導(dǎo)溫度為28℃和37℃，采用解離非連續(xù)緩沖系統(tǒng)垂直板電泳，丙烯酰胺濃度：分離膠12%（V/V），濃縮膠5%（V/V）。每孔上樣6 μL，濃縮膠以70V電壓跑約20 min，分離膠以140V電壓跑約2 h，然后染色、脫色。

1.2.6 目的蛋白純化和濃度測(cè)定及免疫印跡分析 將目的蛋白按最優(yōu)條件誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎提取融合蛋白，利用HisTrap HP親和柱純化融合蛋白，上樣細(xì)胞裂解液后用不同濃度的咪唑洗脫緩沖液洗柱，得到純化蛋白，隨后將收集到的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，加入一抗（鼠抗His單克隆抗體，1∶2 000稀釋）孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；然后，加入二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶500稀釋）孵育1 h，再用TBST清洗3次，每次10 min；最后加入DAB顯色液，待出現(xiàn)明顯條帶后用水終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 Sip、GAPDH基因的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增后分別得到1 305 bp和1 011 bp的兩條特異性條帶（圖1），克隆入pMD18-T載體，菌落PCR、酶切鑒定正確后測(cè)序分析，結(jié)果表明，Sip基因含有一個(gè)1 305 bp的的開放閱讀框（ORF），編碼434個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為45.6 kD，等電點(diǎn)為6.72，其在GenBank上的登錄號(hào)為EIM69670.1。GAPDH基因含有一個(gè)1 011 bp的開放閱讀框（ORF），編碼336個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為36.01 kD，等電點(diǎn)為5.17，在GenBank上的登錄號(hào)為EIM71266.1。

圖1 Sip基因（A）和GAPDH基因（B）的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 Sip-GAPDH融合基因的擴(kuò)增

通過重疊延伸基因拼接擴(kuò)增機(jī)制擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度為2 358 bp的特異性條帶，與預(yù)期相符，表明已將Sip、GAPDH基因已實(shí)現(xiàn)了融合（圖2）。

圖2 Sip-GAPDH基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 融合基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將pET-32a（+）質(zhì)粒與pMD18-Sip-GAPDH質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后連接，構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒命名為pET-32a-Sip-GAPDH。經(jīng)雙酶切鑒定后表明已在pET-32a（+）質(zhì)粒中插入了一段2 358 bp的序列（圖3），結(jié)合測(cè)序結(jié)果確定該原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 重組質(zhì)粒pET-32-Sip-GAPDH質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot分析

將pET-32a-Sip-GAPDH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)優(yōu)化條件（0.1 mmol/L IPTG，5 h，37℃）誘導(dǎo)后可以表達(dá)分子量為102.01 kD左右的融合蛋白（圖4，泳道A7、泳道B6、泳道C6），其中Sip-GAPDH的預(yù)計(jì)分子量為81.61 kD；pET-32a的預(yù)計(jì)分子量為20.4 kD。未經(jīng)誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒pET-32a-Sip-GAPDH的菌體作為陰性對(duì)照，誘導(dǎo)后的蛋白電泳帶與對(duì)照組相比，在102.01 kD處有相應(yīng)條帶（圖4）。Western blot（圖5）證實(shí)pET-32a-Sip-GAPDH重組融合蛋白條帶大小與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，說明表達(dá)產(chǎn)物能與抗體特異性結(jié)合，證實(shí)了該蛋白成功表達(dá)。

圖4 pET-32a-Sip-GAPDH在IPTG濃度（A）、誘導(dǎo)時(shí)間（B）和誘導(dǎo)溫度（C）表達(dá)情況的SDS-PAGE分析

圖5 Sip-GAPDH蛋白的Western blot分析

3 討論

由無乳鏈球菌引起的羅非魚鏈球菌病給我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［11]，而現(xiàn)階段缺乏對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌有效的治療藥物，采用疫苗免疫的策略防控魚類鏈球菌病是最有效的途徑。尋找有效的疫苗靶蛋白是研制高效漁用疫苗的關(guān)鍵。3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）是一種分布在細(xì)胞質(zhì)中，在糖酵解過程中起關(guān)鍵作用的酶，近年來的研究表明，GAPDH是一種多功能蛋白，參與多種細(xì)胞功能的修復(fù)及調(diào)控［12]。此外，病原體接觸到宿主時(shí)，GAPDH可以憑借自身的抗氧化功能改變病原體所處的外界環(huán)境，減少宿主對(duì)病原體產(chǎn)生的氧化毒性作用。因此，GAPDH作為研究疫苗和藥物的重要靶分子，引起了業(yè)內(nèi)的關(guān)注，目前科學(xué)家們已在多種病原生物中進(jìn)行該基因的免疫原性的研究，并證實(shí)了其可作為疫苗候選分子的可能性［13-15]。表面免疫相關(guān)蛋白（Sip）是Brodeur等［16]采用免疫學(xué)篩選方法從基因庫(kù)中鑒定出的一種具有高度保護(hù)性的蛋白，黎炯等［17]將其應(yīng)用到免疫吉富羅非魚中獲得了79%-82.6%的保護(hù)率。嵌合疫苗是在基因水平上改造病原體，將兩種或多種病原體的基因片段用基因工程的方法以不同形式連接或置換，構(gòu)建一個(gè)能表達(dá)兩種或多種病原體抗原物質(zhì)的重組基因，然后采用傳統(tǒng)方法制備疫苗［18]。近年來此類疫苗的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，大量的動(dòng)物試驗(yàn)證明，嵌合疫苗能夠增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)外來抗原免疫應(yīng)答反應(yīng)，具有樂觀的應(yīng)用前景。因此本研究選取了無乳鏈球菌ZQ0910株中高度保守的Sip與GAPDH基因，成功的通過重疊延伸拼接技術(shù)構(gòu)建了Sip-GAPDH融合基因，并進(jìn)行原核表達(dá)，這為探索該融合基因的免疫原性提供有力的理論依據(jù)。

重疊延伸PCR技術(shù)（SOEing PCR）是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，并能在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來的技術(shù)。該技術(shù)的關(guān)鍵是重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)，Link序列的組成對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用，一般選擇氨基酸個(gè)數(shù)在10-15個(gè)堿基，因?yàn)長(zhǎng)inker序列過長(zhǎng)，會(huì)在擴(kuò)增過程中使融合蛋白對(duì)蛋白酶敏感，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。甘氨酸（Gly）由于分子量小，沒有手性碳，是柔性較好的氨基酸，絲氨酸（Ser）是所有氨基酸中親水性最強(qiáng)的氨基酸，因此本研究中選擇大多數(shù)沿用的（Gly4Ser）3作為L(zhǎng)inker序列［19]，鄭黎燕等［20]將帶有Linker序列與不帶Linker序列的融合蛋白進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，接頭Linker序列對(duì)融合蛋白的生物活性沒有影響，這為下一步的工作提供了理論支持。此外，為了保證嵌合序列的正確性，有效地校正擴(kuò)增產(chǎn)物末端的錯(cuò)配堿基，本試驗(yàn)中采用了既具有一般Taq酶5'-3'聚合酶活性，又具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶來進(jìn)行擴(kuò)增，通過測(cè)序及后續(xù)的表達(dá)結(jié)果均能證明擴(kuò)增序列正確性。

pET原核表達(dá)載體是有史以來在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)之一，一旦條件適合，目的蛋白只需誘導(dǎo)幾小時(shí)，即可表達(dá)出占細(xì)胞總蛋白量一半以上。利用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白存在包涵體表達(dá)和可溶性表達(dá)兩種形式，重組蛋白存在于上清中有利于蛋白純化且大都具有活性。本研究選用表達(dá)宿主菌BL21（DE3）和表達(dá)載體pET-32a（+），構(gòu)建無乳鏈球菌Sip-GAPDH原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，通過IPTG誘導(dǎo)及Western blot分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定，相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期相符，說明該原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。此外，本試驗(yàn)中通過表達(dá)得到屬可溶性表達(dá)的蛋白，為后續(xù)試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

外源蛋白的表達(dá)與多種因素有關(guān)，如載體、宿主、外源基因及誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度是能直接影響蛋白表達(dá)的3種關(guān)鍵因子。因此，本試驗(yàn)為獲得最優(yōu)的表達(dá)效率，采用了固定其他因子，對(duì)單個(gè)因子進(jìn)行不同溫度、不同IPTG濃度和不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)后，獲得了一個(gè)最優(yōu)化的表達(dá)體系。本試驗(yàn)中，IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，隨著IPTG濃度的增加表達(dá)量并沒有增加，考慮到高濃度的IPTG對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖會(huì)有毒性作用，所以選擇0.1 mmol/L作為最適誘導(dǎo)濃度。誘導(dǎo)時(shí)間不同也會(huì)導(dǎo)致表達(dá)量的差異，本研究中，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間再5 h以下時(shí)，目的蛋白表達(dá)量會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，并達(dá)到一定的濃度，因此選擇了5 h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。此外，本試驗(yàn)中37℃的誘導(dǎo)表達(dá)量明顯高于其他溫度，推測(cè)可能與大腸桿菌在37℃時(shí)體內(nèi)酶的活性最大以及T7啟動(dòng)子活性最強(qiáng)有關(guān)。通過最佳誘導(dǎo)條件的表達(dá)可以得到大量的Sip-GAPDH融合蛋白，該體系的構(gòu)建為后續(xù)需要大量制備蛋白提供了理論基礎(chǔ)。此外，免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化的目的蛋白與鼠抗His-tag單克隆抗體能產(chǎn)生反應(yīng)，這也從另一個(gè)角度佐證了該蛋白的成功表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究采用重疊延伸PCR技術(shù)將羅非魚源無乳鏈球菌Sip基因和GAPDH基因通過特定的Linker序列進(jìn)行連接，成功地構(gòu)建了無乳鏈球菌Sip-GAPDH融合基因的原核表達(dá)載體。

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