王云龍 張春艷 李玉林 程蕾 王繼創(chuàng) 鄧黎黎 米海 白曉靜

（1.鄭州大學(xué)生物工程系，鄭州 450001；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，鄭州450046；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心，鄭州 450001）

EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬于人類皰疹病毒 γ 亞科，具有較強傳染性和潛伏感染的特點。該病毒在裂解期主要表達立早蛋白、早期蛋白和晚期蛋白3種蛋白［1]。有研究報道［2]，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展和EB病毒感染密切相關(guān)，在鼻咽癌病人血清中可以檢測到EB病毒相關(guān)抗體。由于不同感染狀態(tài)下 EBV 表達的抗原各不相同，因此研究者常通過基因工程或人工合成多肽等方法獲得EB病毒抗原，作為臨床輔助診斷的依據(jù)［3]。

BZLF1編碼的Zta立早蛋白可促使EB病毒從潛伏狀態(tài)進入增殖狀態(tài)，且Zta有較好的抗原性［4]，可用于鼻咽癌的診斷及預(yù)測。另外，有研究報道［5]，BMRF1編碼的P54蛋白是EB病毒的早期蛋白，以EB病毒早期抗原（包括P54蛋白）作為抗原基質(zhì)建立ELISA法，檢測血清中相應(yīng)抗體，對鼻咽癌診斷有好的特異性和敏感性。Dardari等［6]和Chan等［7]的報道及Chan等［8]在世界衛(wèi)生組織腫瘤組織學(xué)分類一書中的觀點，均認為血清學(xué)方法診斷鼻咽癌，采用幾種抗原聯(lián)合檢測能顯著提高特異性和敏感度。

為探討可溶性多抗原聯(lián)合檢測在血清學(xué)診斷鼻咽癌中的價值，本研究嘗試用pET32a作為表達載體，純化Zta-P54融合蛋白作為診斷抗原，以期為后期該蛋白的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和宿主菌 pGEX5T-BZLF1-BMRF1質(zhì)粒、表達菌BL21（DE3）由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，表達載體pET32a購自Novagen公司。

1.1.2 引物設(shè)計 根據(jù)pGEX5T-BZLF1-BMRF1測序結(jié)果，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 主要試劑 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自Sigma公司；蛋白Marker、Taq酶、dNTPs、DNA Marker、T4 DNA連接酶購自天根生化科技（北京）有限公司；鼻咽癌患者的血清取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ購自New England Biolabs公司；DNA膠回收試劑盒購自寶生物公司，Ecl化學(xué)發(fā)光試劑盒購自PIERCE公司，PVDF轉(zhuǎn)印膜購自PALL公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增及原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)所設(shè)計引物，建立30 μL PCR反應(yīng)體系：（5 ×buffer，6 μL；MgCl2，1 μL；dNTP，0.3 μL；上游引物，0.2 μL；下游引物，0.2 μL；Taq酶，0.5 μL；模板，0.5 μL；ddH2O，21.3 μL），反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃ 1 min；60℃ 35 s；72℃ 1.5 min；40個循環(huán)，72℃ 5 min。將擴增產(chǎn)物與pET32a載體分別經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，切取目的基因條帶，用DNA膠回收試劑盒分別回收目的片段和載體片段。由T4 DNA 連接酶16℃過夜連接雙酶切產(chǎn)物，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞BL21（DE3）中，涂布于固體LB培養(yǎng)基中（含Amp），37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆菌落培養(yǎng)至OD值0.6左右，提取質(zhì)粒，將提取質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切正確的產(chǎn)物送至上海生工測序，將測序正確地質(zhì)粒命名為pET32a/BZLF1-BMRF1。

1.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化 挑取陽性菌落，接種于3.5 mL LB液體培養(yǎng)基（含Amp）中，37℃條件下過夜培養(yǎng)，次日取菌液100 μL轉(zhuǎn)接到含有氨芐抗生素的3.5 mL LB培養(yǎng)基中。當(dāng)培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.6時，加入IPTG誘導(dǎo)，以空載體pET32a作為對照。根據(jù)實驗室的經(jīng)驗，同時對菌體進行溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間等條件的優(yōu)化，對不同表達條件的菌體進行SDS-PAGE鑒定，選取最優(yōu)表達條件。

1.2.3 表達菌體的純化前期處理 取穩(wěn)定表達的菌種1 mL接種到1 L的LB液體培養(yǎng)基（含Amp）中，在最佳條件下誘導(dǎo)表達，離心收集菌體。用pH7.8 6 mol/L尿素重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎。離心，取上清進行飽和硫酸銨沉淀，離心，取沉淀透析出去硫酸銨，用pH 7.8 6 mol/L尿素溶解沉淀。將處理過的菌液進行DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA親和層析純化。采用紫外分光光度計測定純化蛋白的含量，按以下公式計算蛋白濃度：

蛋白濃度（mg/mL）= A280×1. 45-2 A260×0. 74。1.2.4 融合蛋白Zta-P54的DEAE-Sepharose CL-6B純化 柱床體積40 mL（3.5 × 4 cm）pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素平衡柱子，用5倍柱體積的0.1、0.5、1.0、2.0 mol/L NaCl，pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素進行線性梯度洗脫，流速1.5 mL/min，收集樣品進行SDS-PAGE檢測。并通過Photoshop分析蛋白灰度并計算蛋白純度。

1.2.5 融合蛋白Zta-P54的Ni-NTA親和柱純化 將DEAE-Sepharose CL-6B柱純化的最佳洗脫蛋白經(jīng)AKTAPrime plus純化儀泵入Ni-NTA親和柱純化，柱床體積25 mL（2.5×5 cm）pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素平衡柱子，用5倍柱體積的20、50、100、200 mmol/L 咪唑，pH8.8 50 mmol/L的Tris-HCl，4 mol/L的尿素進行線性梯度洗脫，流速1.5 mL/min，收集樣品進行SDS-PAGE檢測。分析蛋白灰度并計算蛋白純度。

1.2.6 Western blot檢測蛋白特性 相同上樣量的前期試驗純化的包涵體融合蛋白Zta-P54和本試驗純化后融合蛋白Zta-P54，經(jīng)SDS-PAGE，切膠轉(zhuǎn)膜處理，用10 mg/L的BSA封閉2 h。PBST洗滌4次。加入鼻咽癌患者陽性血清為一抗陽性對照，空質(zhì)粒為陰性對照，37℃溫浴1.5 h，PBST洗膜4次。加入HRP標(biāo)記的鼠抗人-IgG作為二抗，37℃溫浴2 h，PBST清洗后，再用蒸餾水清洗，然后加入Ecl化學(xué)發(fā)光顯色液顯色5 min，暗室曝光1 min，顯影1 min定影6 min，最后結(jié)果分析并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 重組基因的核酸電泳鑒定

將擴增產(chǎn)物BZLF1-BMRF1和重組質(zhì)粒pET32a/BZLF1-BMRF1酶切產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖電泳分析，結(jié)果見圖1，圖2。

由圖1可以發(fā)現(xiàn)約在1 600 bp處的目的條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果相符合；圖2顯示NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切前有一較亮的質(zhì)粒條帶，質(zhì)粒雙酶切后可以看出約1 600 bp處目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 BZLF1-BMRF1 PCR擴增

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 融合蛋白Zta-P54誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化

對菌體進行溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間等表達條件的優(yōu)化，并進行SDS-PAGE鑒定。

重組的質(zhì)粒經(jīng)不同IPTG濃度誘導(dǎo)，電泳檢測誘導(dǎo)表達結(jié)果，通過灰度分析，顯示在IPTG濃度為0.2 mmol/L時蛋白表達量最高，見圖3，圖4。

圖3 IPTG優(yōu)化電泳檢測

圖4 IPTG灰度分析圖

重組的質(zhì)粒在37℃條件下，IPTG濃度為0.2 mmol/L時，改變誘導(dǎo)時間，經(jīng)電泳檢測并對電泳結(jié)果進行灰度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)6 h時蛋白表達量最高見，圖5，圖6。

IPTG濃度為0.2 mmol/L時，通過改變誘導(dǎo)溫度發(fā)現(xiàn)37℃條件下誘導(dǎo)6 h時蛋白表達量最高見圖7，圖8。

綜上所述，條件優(yōu)化后，最終得到最佳誘導(dǎo)表達條件為37℃，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h蛋白表達量最高，蛋白分子量約為60 kD，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 融合蛋白的可溶性分析及蛋白純化

將重組質(zhì)粒在最佳條件下誘導(dǎo)表達、收集菌液、離心菌體、破菌、分上清和沉淀電泳分析蛋白可溶性，發(fā)現(xiàn)該蛋白在大腸桿菌中可溶性表達（圖9）通過DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA親和層析純化，經(jīng)SDS-PAGE和Photoshop進行灰度分析（圖10）。

圖5 誘導(dǎo)時間優(yōu)化電泳檢測

圖6 時間灰度分析

圖7 誘導(dǎo)溫度梯度優(yōu)化電泳檢測

圖9 重組蛋白Zta-P54可溶性表達電泳

圖10 重組蛋白Zta-P54的純化

由圖9顯示目的蛋白Zta-P54主要以可溶性的形式存在；經(jīng)SDS-PAGE和Photoshop軟件灰度分析發(fā)現(xiàn)（圖10）通過DEAE柱純化后Zta-P54蛋白的總灰度為9 730，總條帶灰度為12 139，計算得出蛋白純度80 %；經(jīng)Ni-NTA親和柱純化后蛋白的總灰度為27 435，總條帶灰度為28 441，計算得出蛋白純度96.5 %，采用紫外分光光度計法測定純化后蛋白總量為18 mg，即1 L菌液可以純化得到18 mg Zta-P54融合蛋白。

2.4 Western blot結(jié)果分析

通過Western blot檢測融合蛋白 Zta-P54免疫原性及反應(yīng)特異性，表達產(chǎn)物Zta-P54為陽性對照，空質(zhì)粒為陰性對照，加入鼻咽癌患者陽性血清反應(yīng)，結(jié)果見圖11，圖12。由圖11，圖12可知，融合蛋白Zta-P54與鼻咽癌患者陽性血清混合反應(yīng)后，在60 kD出現(xiàn)特異性反應(yīng)帶；而空載質(zhì)粒pET32a相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn)，且可溶性Zta-P54融合蛋白較包涵體Zta-P54融合蛋白有更好的反應(yīng)特異性。

3 討論

圖11 Western blot檢測

圖12 Western blot灰度分析

EB病毒作為一種嗜B淋巴細胞的人類皰疹病毒，它與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤、單核細胞增多癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前廣東地區(qū)鼻咽癌的發(fā)病率較高，且已經(jīng)成為一種較典型的地方性惡性腫瘤疾病，所以鼻咽癌的早期診斷尤為必要，其中用EB病毒抗原檢測病人血清中的抗EB病毒的抗體用來篩查鼻咽癌這一疾病的研究備受關(guān)注［9]。目前，隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有多種EB病毒抗原通過基因工程表達和人工合成的方式被純化出來，并且用作診斷抗原進行了ELISA法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等方法的研究［10，11]，這些單個診斷抗原雖然提高了特異性，但敏感度還不夠。因此，可以應(yīng)用多種EB病毒抗原聯(lián)合檢測，不但可拓寬了抗體反應(yīng)譜，還可以提高ELISA法的敏感度［12]。

目前，張毅等［13]報道所表達的EB病毒融合抗原多以包涵體形式表達。為提高蛋白活性，本研究選擇抗原性較好的立即早期蛋白Zta和早期蛋白P54融合表達。由于前期研究發(fā)現(xiàn)pGEX5T-BZLF1-BMRF1載體所表達的Zta-P54蛋白為包涵體［14]，所以更換pET32a作為表達載體，該載體帶有的Trx標(biāo)簽是高度可溶性多肽，增強了目的蛋白的可溶性。同時，本研究所選序列引入有一段24 bp的連接肽，它編碼的氨基酸為GGGGSGGG，其中甘氨酸沒有手性碳原子，柔性較好，在融合蛋白之間不會影響兩邊蛋白各自的構(gòu)象和功能；而絲氨酸是親水性最強的氨基酸，可以提高融合蛋白的親水性。將兩種氨基酸串聯(lián)起來作為連接肽可以保持兩蛋白原有的生物活性。通過優(yōu)化誘導(dǎo)溫度、時間、誘導(dǎo)劑濃度等條件，實現(xiàn)了Zta-P54的可溶性表達。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白較包涵體蛋白反應(yīng)特異性性強，克服了包涵體蛋白活性低的缺點。試驗發(fā)現(xiàn)在溫度為37℃、誘導(dǎo)時間6 h、IPTG濃度0.2 mmol/L 的條件下目的蛋白表達量最高。試驗過程發(fā)現(xiàn)該蛋白較易降解，所以純化前用6 mol/L尿素處理菌體及飽和硫酸銨沉淀目的蛋白。這一過程既除去了部分雜蛋白又有效的減緩了融合蛋白Zta-P54的降解。最后，通過DEAE-Sepharose CL-6B和Ni-NTA親和層析純化，得到純度高達96.5%的Zta-P54融合蛋白，收率可達到18 mg/L。Western blot檢測表明該蛋白可與鼻咽癌患者血清中相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，有良好的免疫原性及反應(yīng)特異性。Zta-P54蛋白是我們表達的一種全新的兩抗原融合蛋白，將該蛋白應(yīng)用到鼻咽癌早期診斷和篩查中將會有更好的敏感度和特異性，可降低鼻咽癌的漏診率，且可利用原核表達方法快速、大量生產(chǎn)該蛋白。

4 結(jié)論

本試驗成功純化得到可溶性、高純度的融合蛋白Zta-P54，且該蛋白有較好的免疫原性，Zta-P54融合蛋白在EB病毒相關(guān)疾病的診斷上將具有良好的臨床應(yīng)用前景。

［1] Feederle R, Kost M, Baumann M, et al. The Epstein-Barr virus lytic program is controlled by the co-operative functions of two transactivators［J] . EMBO J, 2000, 19（12）：3080-3089.

［2] 顧耀亮, 張昌卿, 吳子柏, 等．抗重組EB病毒雙重抗體鼻咽癌血清學(xué)研究［J] ．癌癥, 2003, 22（9）：903-906．

［3] Islam MS, Anoop P, Gordon-Smith EC, et al. Epstein-Barr virus infections after allogeneic stem cell transplantation A comparison between nonmalignant and malignant hematological disorder［J] .Hematology, 2010, 15（5）：344-350.

［4] Chan KH, Gu YL, Ng F, et al. EBV specific antibody-based and DNA-based assays in serologic diagnosis of nasopharyngeal carcinoma［J] . Cancer, 2003, 105（5）：706-709.

［5] Paramita DK, Fachiroh J, Artama WT, et al. Native early antigen of Epstein-Barr virus a promissing antigen for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma［J] . J Med Virol, 2007, 79（11）：1710-1721.

［6] Dardari R, Hinderer W, Lang D, et al. Antibody responses to recombinant Epstein-Barr virus antigens in nasopharyngeal carcinoma patients：Complementary test of ZEBRA protein and early antigens p54 and p138［J] . J Clin Micro, 2001, 39（9）：3164-3169.

［7] Chan KH, Gu YL, Ng F, et al. EBV specific antibody-based and DNA-based assays in serologic diagnosis of nasopharyngeal carcinoma［J] . Int J Cancer, 2003, 105（4）：706-709.

［8] Chan JKC, Pilch BZ, Bray F, et al. Nasopharyngeal carcinoma［M] //Barnes L, Eveson JW, Reichart P, Sidransky D. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology&Genetics. Head and Neck Tumours. Lyon France：IARC-Press, 2005：85-97.

［9] Allen MD, Young LS, Dawson CW. The Epstein-virus encoded LMP2A and LMP2B proteins promote epithelial cell spreading and motility［J] . Virol, 2005, 79（6）：1789-1802.

［10] 伊強, 王文華, 陳丹, 等．以合成肽為抗原建立ELISA試驗檢測鼻咽癌患者EB病毒抗體的研究［J] ．中華腫瘤防治雜志,2008, 15（8）：610-611．

［11] Hoebe EK, hutajulu SH, VanBeek J, et al. Purified hexameric Epstein-virus encoded BARF1 protein for measuring anti-BARF1 antibody responses in nasopharyngeal carcinoma patients［J] .Clin Vaccine Immunol, 2011, 18（2）：298-304.

［12] Fachiroh J, Stevens SJ, Haryana SM, et al. Combination of Epstein-virus scaffold（BDRF1/VCA-p40）and small capsid protein（BFRF3/VCA-p18）into a single molecule for imprived serodiagnosis of acute and malignant EBV-driven disease［J] . J Virol Methods, 2010, 169（1）, 79-86.

［13] 張毅, 周淑艷, 孫業(yè)紅, 等．EB病毒融合蛋白 ztaN-p23 在大腸桿菌中的表達、純化及活性鑒定［J] ．細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2012, 28（2）：120-123．

［14] 伊強.以原核表達的EB病毒融合蛋白p54-ztaN為抗原建立ELISA方法及其在鼻咽癌診斷中的應(yīng)用［D] .福建：福建醫(yī)科大學(xué), 2008．