易龍等

摘要：鏈霉菌是一種生防菌，可用于防治多種植物病害。本文介紹了鏈霉菌分類、對植物病害的生防機(jī)制，重點(diǎn)討論了鏈霉菌提高防治植物病害的途徑，提出了鏈霉菌應(yīng)用研究中存在的主要問題，并對其進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌；生物防治；植物病害；生防機(jī)制；研究進(jìn)展

中圖分類號： S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0091-04

20世紀(jì)50年代以來，化學(xué)農(nóng)藥在糧食生產(chǎn)中起著舉足輕重的作用，然而化學(xué)農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，造成了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、破壞生態(tài)平衡及病菌產(chǎn)生抗藥性等問題。這促使各國政府、企業(yè)從過去單一開發(fā)化學(xué)農(nóng)藥，轉(zhuǎn)而投入大量的人力、財力和物力開發(fā)生物農(nóng)藥。近年來，越來越多的生物農(nóng)藥商品化，開發(fā)對人類以及環(huán)境友好的、防治效果良好的、新的植物病蟲害生物防治方法一直是各國科學(xué)家研究的熱門領(lǐng)域[1]。鏈霉菌（Streptomyces）是高等放線菌，可產(chǎn)生多種抗生素、植物激素等活性物質(zhì)，對提高植物的抗病、抗逆性能具有重要的作用，具有開發(fā)生物農(nóng)藥的潛力[2-3]。國內(nèi)外對鏈霉菌防治植物病害鮮見綜述報道，本文對國內(nèi)外的鏈霉菌防治植物病害的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述，并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期進(jìn)一步發(fā)揮鏈霉菌的生防作用，實(shí)現(xiàn)其代謝活性物質(zhì)的高產(chǎn)量、工業(yè)化及開發(fā)低毒、高活性的新型物質(zhì)，使其更好地為農(nóng)業(yè)服務(wù)。

1 鏈霉菌的分類

長期以來，鏈霉菌缺少統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)，直到1943年Waksman等才首次建立了鏈霉菌屬[4]。1962年，鏈霉菌數(shù)值分類方法得到應(yīng)用，Kmpfer等用數(shù)值分類法測定了鏈霉菌屬和鏈輪絲菌屬821個菌株的329個特征[5]。但后來發(fā)現(xiàn)鏈霉菌種的數(shù)量太大，而化學(xué)分類比數(shù)值分類更適合分析大量菌株，并有極高的可重復(fù)性。Manchester等通過全細(xì)胞蛋白SDS-PAGE圖譜分析，快速、準(zhǔn)確地對大量鏈霉菌菌株進(jìn)行了分類[6]。20世紀(jì)80年代，隨著核酸測序技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)發(fā)育樹成為研究鏈霉菌分類地位最有效的方法。近年報道的鏈霉菌新種多是由16S rRNA序列分析確定的。Slim等基于16S rRNA基因的核苷酸序列，將TN17的放線菌確定為典型的鏈霉菌[7]。目前，鏈霉菌分類學(xué)研究發(fā)展為多相分類，即綜合考慮傳統(tǒng)的表型分類（形態(tài)和生理生化特征）、數(shù)值分類、化學(xué)分類和分子分類等各種信息，以確定菌株的分類地位。文才藝等通過確定形態(tài)特征、生理生化特性、細(xì)胞壁組分和16S rRNA基因序列的序列綜合分析，將分離的放線菌SCY311確定為圓突起鏈霉菌[8]。但我國國內(nèi)與國際研究仍存在差距，不僅使發(fā)表的新種得不到國際承認(rèn)，而且加大了開發(fā)以及利用鏈霉菌資源的難度。鏈霉菌是一個高度分化的菌屬，不同菌種之間有很大的差異，因此研究鏈霉菌的分類，建立快速、準(zhǔn)確的鏈霉菌鑒定方法是目前我國鏈霉菌研究的重要課題，也是研究鏈霉菌防治植物病害的前提。

2 鏈霉菌生防機(jī)制

關(guān)于鏈霉菌的生防作用機(jī)制，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究。鏈霉菌對植物病害的生防作用機(jī)制包括拮抗作用、競爭作用和誘導(dǎo)植物抗性作用等方面，其生防效果往往不是單方面的，而是以上幾種方式作用的綜合結(jié)果，不同生防機(jī)制之間往往存在著協(xié)同作用。

2.1 拮抗

拮抗作用是微生物界的普遍現(xiàn)象。鏈霉菌能利用拮抗作用抑制其他植物病原微生物，即通過鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物以及新的生物活性達(dá)到防治植物病害的目的[9-10]。申屠旭萍等報道了豐加霉素對水稻紋枯病菌、葡萄炭疽病菌和番茄灰霉病菌等7種植物病原真菌有很好的拮抗作用[11]。Harikrishnan等從土壤中分離的鏈霉菌VSMGT1014乙酸乙酯提取物有明顯抑制真菌菌絲生長、孢子和菌核萌發(fā)的作用[12]。Oskay研究了鏈霉KEH23菌株，發(fā)現(xiàn)其對人類致病細(xì)菌有抗菌活性，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌，且該菌可作為植物和人類的病原體生物防治劑[13]。Jayakumar等認(rèn)為，阿維鏈霉菌發(fā)酵液對根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲和腎形線蟲有拮抗作用[14-15]。鏈霉菌可在代謝過程中產(chǎn)生抗生素和酶類等活性物質(zhì)，來拮抗病原菌的生長、繁殖和侵染。

2.1.1 抗生素 鏈霉菌可通過產(chǎn)生抗生素來發(fā)揮拮抗作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素約為微生物產(chǎn)生的抗生素總量的90%[16]。作為生物農(nóng)藥的一個重要分支，農(nóng)用抗生素因具有高效、無殘留、易分解、與環(huán)境相容等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視。細(xì)黃鏈霉菌（S. microflavus）產(chǎn)生的大環(huán)二酯類抗病毒抗生素Fattiviracins，對多種有包膜的DNA和RNA病毒有活性[17]。對鏈霉菌抗生素的研究很多，其他不再一一列舉（表1）。

2.1.2 酶類 鏈霉菌通過產(chǎn)生各種酶類抑制、降解、水解其他病原體，也是表現(xiàn)在防治植物病害上的一種途徑。萬平平等篩選出產(chǎn)β-1，3-葡聚糖酶的鏈霉菌，證明該酶對小麥紋枯病菌抑制作用很強(qiáng)，盆栽防病試驗(yàn)表明，小麥的種子通過酶液處理后，防病效果為64.28%[36]。Morita等提純了作用于細(xì)胞壁肽聚糖的溶菌酶，該溶菌酶可以破壞細(xì)胞壁使微生物裂解死亡，而且對人和動植物沒有明顯毒性，安全可靠[37]。鏈霉菌WYEC108分泌的幾丁質(zhì)酶，可通過催化幾丁質(zhì)的水解破壞植物病原真菌細(xì)胞壁的主要成分，從而具有抑制植物病害發(fā)展的作用[38-39]。Singh等從鏈霉菌A6純化得到抗真菌絲氨酸蛋白酶[40]。Bielen等研究了天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)生可作為生物催化劑的酯酶[41]。

2.2 競爭

目前研究的生防菌多數(shù)具有與病原菌的競爭作用，這也是生防微生物發(fā)揮作用的主要機(jī)制之一。競爭作用包括營養(yǎng)競爭和空間競爭?？臻g競爭是生防菌對植物表面空間或內(nèi)部空間尤其是病原菌侵入位點(diǎn)的爭奪，生防菌預(yù)先定殖在植物表面阻止病原菌的直接侵入。鏈霉菌可以通過快速生長和繁殖而奪取養(yǎng)分和水分、占有空間、消耗氧氣等，以致削弱和排除同一生存環(huán)境中的某些病原物。鏈霉菌對生存空間和營養(yǎng)資源的競爭作用特別強(qiáng)，可以利用這一特點(diǎn)來排斥病原菌。endprint

2.3 誘導(dǎo)植物抗性作用

在關(guān)注生防菌與致病菌之間相互作用的同時，也不能忽略其對寄主植株的作用，很多微生物可以誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生防御反應(yīng)，使得局部或系統(tǒng)獲得抗性。張穗發(fā)現(xiàn)，吸水鏈霉菌可使水稻葉片中的過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性防衛(wèi)反應(yīng)，具有激發(fā)水稻抗性防衛(wèi)反應(yīng)表達(dá)的特性[42]。鏈霉菌組成型表達(dá)載體pIB139攜帶的紅霉素強(qiáng)啟動子與目的基因的優(yōu)化及生物合成，可以直接與植物相互作用，誘導(dǎo)植物抗性，與抗生素協(xié)同抗病[43]。

3 提高鏈霉菌防治植物病害效果的途徑

由于鏈霉菌防治植物病害時存在防治效果難以穩(wěn)定、持久等缺點(diǎn)，尋找提高鏈霉菌防治植物病害效果的途徑顯得十分重要。提高鏈霉菌防治植物病害效果的途徑有誘變育種、固定化技術(shù)和改良發(fā)酵工藝等，其目標(biāo)是為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度，減少副產(chǎn)物，改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品。人們經(jīng)常通過種內(nèi)融合或者紫外誘變等方式提高鏈霉菌分泌抗生素的能力，以提高其抑菌能力[44-45]。

3.1 誘變育種

人工誘變能提高突變頻率和擴(kuò)大變異譜，具有速度快、方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前菌種選育的一種方法。我國在利用太空輻射誘變對尼可霉素產(chǎn)生菌圈狀鏈霉菌的影響時發(fā)現(xiàn)，其主要生物活性組分X和Z的含量均有所提高[46]。車洪杰采用紫外線誘變和氯化鋰加紫外線復(fù)合誘變的方法對普特拉鏈霉菌F-1進(jìn)行誘變改良，增強(qiáng)了其防病效果，降低了抗真菌物質(zhì)分離純化的難度[47]。張茜茜等對吸水鏈霉菌井岡變種進(jìn)行了 60Co γ射線、亞硝酸-紫外和紫外復(fù)合誘變，經(jīng)過逐級誘變篩選出一株高產(chǎn)菌株F-101，該菌株的代謝產(chǎn)物井岡霉素A組分含量比原菌株高33.5%[48]。

3.2 固定化技術(shù)

固定化微生物技術(shù)于20世紀(jì)80年代興起，是一種具有良好發(fā)展前景的新型生物技術(shù)，有利于提高生物反應(yīng)器內(nèi)微生物細(xì)胞濃度和純度、保持高效菌種、二次污染小等。朱祥瑞等用蠶絲為載體材料通過吸附和交聯(lián)方法制備成固定化鏈霉菌，其活性比游離鏈霉菌高，適應(yīng)范圍廣[49]。用微生物固定化細(xì)胞方法生產(chǎn)生物工程產(chǎn)品早已有報道，從海底泥分離的灰棕褐鏈霉菌（p-33）產(chǎn)生α，β-不飽和γ-內(nèi)酯類抗生素，將其固定在硅藻土中進(jìn)行發(fā)酵，其抗菌活性提高2倍，抗生素產(chǎn)量提高2.6倍。朱啟忠等研究了鏈霉菌Strz-2木聚糖酶被固定化后的酶活性變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶優(yōu)于原酶[50]。Ibrahim將海藻酸鈣固定化細(xì)胞作為生物催化劑，結(jié)果表明固定化細(xì)胞的鏈霉菌對抗微生物病原體更有效[51]。

3.3 發(fā)酵工藝

發(fā)酵可以使鏈霉菌富集，從而獲取大量防治植物病害的活性物質(zhì)。為了讓鏈霉菌更好發(fā)揮生防作用，優(yōu)化鏈霉菌的發(fā)酵工藝顯得十分有意義。邱立友等將鏈霉菌A048采用幾丁質(zhì)和纖維素雙因子誘導(dǎo)二步發(fā)酵，產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性比只加幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的高4倍[52]。駱健美等用最陡爬坡路徑、中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析方法得到褐黃孢鏈霉菌納他霉素發(fā)酵條件較佳的試驗(yàn)點(diǎn)，與原始培養(yǎng)條件相比，納他霉素產(chǎn)量提高了2倍[53]。Adinarayana等優(yōu)化了生產(chǎn)新霉素的弗氏鏈霉菌半固態(tài)發(fā)酵，新霉素含量可達(dá)250 μg/mL[54]。劉薇等進(jìn)行了串珠霉與鏈霉菌2株菌株混合協(xié)同互助發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，使得纖維素酶比優(yōu)化前提高了111～5.57倍[55]。

3.4 核糖體工程

核糖體工程是通過對核糖體和 RNA 聚合酶進(jìn)行修飾和改造，激活細(xì)胞自身潛能，可引入特定的抗生素抗性突變，篩選出高效抗性突變株，提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，可用于鏈霉菌生物合成潛能的提高及其他性狀的改良。Ochi提出了核糖體工程育種技術(shù)的概念[56]。Shima等發(fā)現(xiàn)，向變鉛青鏈霉菌核糖體中引入某些點(diǎn)突變，會顯著提高放線菌紫紅素的產(chǎn)生量[57]。李曉玲等應(yīng)用核糖體工程技術(shù)對白淺灰鏈霉菌進(jìn)行改造，豐富了白淺灰鏈霉菌次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性，探索了天然產(chǎn)物資源有限的問題[58]。

3.5 基因工程

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，以基因工程為核心的菌種改良方法有望發(fā)展成為定向改良現(xiàn)有微生物殺菌劑性能和降低生物農(nóng)藥生產(chǎn)成本的主導(dǎo)技術(shù)。通過基因工程可以激活抗生素的沉默基因獲得新的抗生素，改良抗生素的生產(chǎn)菌等。張桂敏等將透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）克隆到含鏈霉菌ФC31噬菌體整酶，attP基因的誘導(dǎo)型表達(dá)載體pIJ8600上，pHZl276通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入變鉛青鏈霉菌，vgb基因在該菌中表達(dá)出有活性的VHb蛋白，從一定程度上解決了鏈霉菌發(fā)酵中的溶氧問題，提高了抗生素產(chǎn)量[59]。日本學(xué)者Hotta等通過將灰色鏈霉菌和天神島鏈霉菌種間基因組重排，篩選到一種完全不同于親株的非氨基糖苷類抗生素吲哚佐霉素[60]。Zhang等運(yùn)用基因工程快速提高弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的能力[61]。廖國建等通過增加相關(guān)關(guān)鍵酶基因（sanU、sanV、sanG）的拷貝數(shù)成功提高尼可霉素的產(chǎn)量[62]。Mazodier等于1989年通過接合轉(zhuǎn)移的方法把質(zhì)粒DNA從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到變鉛青鏈霉菌中，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒在大腸桿菌和鏈霉菌之間的跨屬轉(zhuǎn)移[63]。

4 存在的問題及展望

鏈霉菌在生物防治和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域具有重大應(yīng)用前景，是許多病原微生物的生防因子，也是目前研究應(yīng)用廣泛的生防菌。隨著鏈霉菌研究的不斷擴(kuò)展和深入，相信會有更多鏈霉菌被篩選，進(jìn)而豐富我國的鏈霉菌種群及其系統(tǒng)分類學(xué)研究。篩選優(yōu)良菌株或利用基因工程技術(shù)和原生質(zhì)體融合技術(shù)，為構(gòu)建高產(chǎn)、高效鏈霉菌的生防菌株防治植物病害等提供有力的保障。盡管鏈霉菌在生物防治中取得了一定的成就，但從整體上看還存在一些問題。例如，病原物對抗生素的耐藥性增強(qiáng)，使得新抗生素的數(shù)量呈直線下降趨勢發(fā)展[64]；大多數(shù)生防鏈霉菌篩選都是在試驗(yàn)的條件下進(jìn)行的，沒有進(jìn)行田間試驗(yàn)，而在田間自然條件下生防菌株的生防能力也會有所變化，防效不穩(wěn)；鏈霉菌中許多的功能物質(zhì)、定殖規(guī)律和作用機(jī)理不明確，影響其發(fā)揮作用，而鏈霉菌能否成功定殖在植物葉表面和根部形成優(yōu)勢種群，是其大規(guī)模商品化應(yīng)用于農(nóng)業(yè)上的一個關(guān)鍵因子[65-66]。有研究表明，環(huán)境中的溫度、濕度、天氣等都會影響鏈霉菌在植物表面和土壤中的定殖、繁殖和擴(kuò)展情況。endprint

今后研究可以包括以下方面：（1）采用現(xiàn)代發(fā)酵工程和代謝工程技術(shù)研究微生物定向發(fā)酵調(diào)控工藝。建立優(yōu)化的發(fā)酵、增殖生產(chǎn)工藝技術(shù)，提高有效活性物質(zhì)的生產(chǎn)率。（2）用抗病機(jī)制有交叉的生防菌復(fù)配協(xié)同抗病。許多學(xué)者的研究表明，使用幾種拮抗菌的混合物可以獲得良好的病害防治效果[67-68]，多菌復(fù)配可以拓寬鏈霉菌使用范圍，防治多種病原菌；可以增強(qiáng)其有效性，減少使用頻率，可結(jié)合不同微生物的防治優(yōu)勢，提高生防效果。（3）通過對鏈霉菌的遺傳改良包括提高抗菌物質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)競爭能力和誘導(dǎo)抗性等，增強(qiáng)其抗菌活性，擴(kuò)大抑菌譜，增強(qiáng)在植物寄主上的定殖能力，從而提高防病能力。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的運(yùn)用，鏈霉菌的研究及開發(fā)應(yīng)用將會出現(xiàn)新的發(fā)展，對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，同時有較強(qiáng)的市場競爭力和良好經(jīng)濟(jì)效益，能產(chǎn)生巨大的社會、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益，將會有廣闊的應(yīng)用前景。

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