程蘭香等

摘要：采用蒸餾水加熱回流提取馬尾松不同部位中的莽草酸，用高效液相色譜法測定其莽草酸含量，并比較了不同樹齡的馬尾松松針中的莽草酸含量。結(jié)果表明：馬尾松成熟松針中莽草酸的含量高于其他部位，最高為3.289%，老樹皮中莽草酸含量最低，為0.04%；隨著樹齡的增長，松針中莽草酸含量逐漸減少，其中樹齡為5年的馬尾松松針中莽草酸含量最高，為3.435%，樹齡為10年的馬尾松松針次之，為3.274%。綜合考慮，樹齡為10年的馬尾松成熟松針具有較高開發(fā)價值。

關(guān)鍵詞：馬尾松；莽草酸；含量測定；高效液相色譜

中圖分類號： O657.7+2；R284.1 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0260-03

馬尾松（Pinus massoniana）是我國松屬樹種地理分布最廣的一種，廣泛分布于我國亞熱帶東南部濕潤區(qū)，其生態(tài)環(huán)境復(fù)雜，變幅很大，是中國最重要的常見樹種之一[1]。松樹藥用的代表部位是松針，松針的藥用成分高于松樹的其他部位，不但含有大量生物黃酮類物質(zhì)、莽草酸、木脂素，還富多種維生素，現(xiàn)代研究表明松針提取物具有抗氧化、抗突變、降血脂、降血糖等功能[2-4]。

莽草酸，化學(xué)名為3，4，5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-甲酸，是一種易溶于水的白色精細粉末，是各種芳香族化合物的來源，也是一些次生代謝產(chǎn)物的重要原料。莽草酸通過影響花生四烯酸代謝，可作為抗病毒和抗癌藥物中間體，不僅抑制動、靜脈血栓及腦血栓形成，還能抑制血小板聚集，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[5]。

莽草酸最早是從有劇毒的日本八角茴香花朵中分離出來的。在美國大量分布的北美楓香樹的樹葉和種子中也含有莽草酸，種子中其含量為3.7%[6]。據(jù)國外研究報道，幾種松樹如冷杉、云杉等的針葉中含有莽草酸，歐洲赤松松針中莽草酸含量為1.6%[7]。國外對于馬尾松松針中莽草酸的提取與測定幾乎沒有報道。目前，中國八角茴香是莽草酸主要的提取來源，其含量高達10%左右，但是僅從八角茴香里提取，無法滿足市場對莽草酸的需求，而且提取成本高[8]。此外，莽草酸還可以通過微生物代謝、化學(xué)合成、微生物生物轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生[9]。據(jù)報道，馬尾松松針中也含有莽草酸，國內(nèi)對于馬尾松松針中莽草酸的提取與測定研究報道較多，但對馬尾松不同部位的莽草酸含量測定報道較少，對不同樹齡的馬尾松松針中莽草酸含量測定尚未報道。為了更合理充分地開發(fā)和利用馬尾松資源，篩選更理想的莽草酸提取原料資源來源，科學(xué)地實現(xiàn)自然生態(tài)建設(shè)與資源高效開發(fā)利用，對生態(tài)林中馬尾松不同部位與不同樹齡的馬尾松松針中莽草酸含量進行了研究分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬尾松樣品，采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)自然生態(tài)林；莽草酸標(biāo)樣（貴州迪大生物有限公司，純度≥98%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

LC-10Avp高效液相色譜儀（日本島津公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)型蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004N電子天平（上海菁海儀器有限公司）；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；電動離心機（常州澳華儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)樣儲備液的制備 精確稱取干燥至恒重的莽草酸標(biāo)樣10.0 mg，置于100 mL容量瓶中用超純水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)樣儲備液。

1.3.2 樣品供試液的制備 精確稱取已干燥粉碎（過60目篩）的馬尾松樣品（馬尾松各部位樣品均來自同一條件下的原料，不同樹齡的松針均為成熟松針）2.0 g于圓底燒瓶中，加入40 mL蒸餾水95 ℃下回流提取2.5 h。提取液過濾，離心，在減壓水浴裝置下濃縮，將濃縮液倒入100 mL容量瓶中用超純水定容至刻度。從容量瓶中移取1 mL提取液于 25 mL 容量瓶中用超純水定容至刻度，臨用前用0.45 μm微孔濾膜過濾。

莽草酸含量=提取液中莽草酸的質(zhì)量/樣品的質(zhì)量×100%。

1.3.3 色譜條件 島津LC-10Avp型高效液相色譜儀，SPD-10Avp 檢測器。色譜柱：Shodex Asahipak NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：乙腈 ∶ 2%H3PO4（體積比 80 ∶ 20）；流速：0.8 mL/min。測定波長213 nm，柱溫40 ℃。對照品溶液和供試品溶液分別進樣20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確量取莽草酸標(biāo)樣儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 分別置10 mL容量瓶中，加入超純水稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾待用。分別精確吸取莽草酸對照品溶液20 μL注入色譜儀，測得峰面積。以標(biāo)樣峰面積（y）對濃度（x）進行線性回歸分析，求出回歸方程：y=62 882x+21 111，r2=0.999 7，在500～30.00 μg/mL的范圍內(nèi)，莽草酸濃度對峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗

精確吸取莽草酸標(biāo)樣溶液（20.00 μg/mL）20 μL，重復(fù)進樣5次，測定色譜峰峰面積分別為1 275 831、1 274 462、1 260 014、1 286 493、1 270 026，其RSD為0.767%，精密度良好，符合分析要求。

2.3 重復(fù)性試驗

稱取馬尾松松針粉末（樹齡為10年左右的成熟松針，過60目）2.0 g，按樣品測定法重復(fù)測定5次，測得莽草酸含量分別為3.228%、3.197%、3.288%、3.256%、3.19%，平均值為3.262%，RSD為1.216%，重復(fù)性良好，符合分析要求。endprint

2.4 穩(wěn)定性試驗

取松針供試液，在“1.3.3”節(jié)色譜條件下，于0、4、8、12、24 h分別測定莽草酸峰面積，分別為1 645 591、1 630 190、1 655 802、1 649 043、1 638 921，計算峰面積的RSD為0769%，表明樣品供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收試驗

精確稱取已知含量的馬尾松松針粉末2.0 g，共5份，分別精確加入規(guī)定量的莽草酸標(biāo)樣，按樣品供試液制備及測定法操作，分別進行色譜分析，其平均回收率為97.621%，RSD為0.949%，符合分析要求，結(jié)果見表1。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品的預(yù)處理以及提取溶劑的選擇

據(jù)文獻報道，莽草酸隨著松針存放時間的延長而逐漸減少，可能是因為在莽草酸激酶的作用下，松針中的莽草酸經(jīng)莽草酸途徑代謝生成多種芳香族化合物，為了避免莽草酸的代謝轉(zhuǎn)化，采集的馬尾松松針樣品應(yīng)該及時烘干[10]。

莽草酸是小分子有機弱酸，易溶于水，在水中的溶解度為 180 g/L，難溶于三氯甲烷、苯和石油醚，并且水的成本較低，提取后無有害有機溶劑殘留，經(jīng)濟環(huán)保，所以采用水作為提取溶劑。

3.2 樣品中莽草酸提取工藝的優(yōu)化

精確稱取同一批馬尾松樣品干燥粉末2.5 g，對影響莽草酸提取效率的4個因素進行考察，設(shè)計4因素3水平的正交試驗，即提取時間（1.5、2、2.5 h）、提取溫度（75、85、95 ℃）、料液比（1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25）及原料粒度（40、60、80目）。試驗結(jié)果表明：提取時間為2.5 h，提取溫度為95 ℃，料液比為1 ∶ 20，粒度為60目，提取效率最高。

3.3 方法的確定與含量分析

采用HPLC法測定馬尾松樣品中莽草酸的含量，該方法準(zhǔn)確性、精確度和重復(fù)性良好，適合測定松針及其他天然植物中莽草酸的含量。由結(jié)果分析可知，馬尾松的成熟松針具有較高的開發(fā)價值，在不同樹齡的馬尾松中，數(shù)齡為10年的馬尾松適合開發(fā)利用，可以在不破壞植被的情況下最大限度地利用自然資源。

3.4 研究意義

本課題研究對資源的開發(fā)和利用提供了研究方法和應(yīng)用基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，對馬尾松生態(tài)林的建設(shè)、資源開發(fā)、生態(tài)修復(fù)提供了科學(xué)依據(jù)，對資源利用的節(jié)約化和高效利用均具有重要的綜合意義。對于松針中莽草酸的分離純化、成品制取、提取后廢料的資源再利用，本課題組正在進行進一步的深入研究。

參考文獻：

[1]李 丹，彭少麟. 馬尾松地理種源遺傳變異規(guī)律研究的綜述與分析[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2000，11（2）：293-296.

[2]陳 英，劉成國，趙毓芝，等. 松針功能性成分及應(yīng)用研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：5994-5996.

[3]張 霞，孫愛東. 松針提取物的研究進展[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2009（9）：23-25.

[4]鄭曉珂，王小蘭，馮衛(wèi)生. 松針提取物降血脂作用研究[J]. 中藥藥理與臨床，2008，24（3）：81-82.

[5]顧小文，朱開梅. 莽草酸及其衍生物醫(yī)學(xué)作用的研究進展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（6）：1099-1101.

[6]Martin E，Duke J，Pelkki M，et al. Sweetgum （Liquidambar styraciflua L.）： extraction of shikimic acid coupled to dilute acid pretreatment[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162（6）：1660-1668.

[7]Ghosh S，Chisti Y，Banerjee U C. Production of shikimic acid[J]. Biotechnology Advances，2012，30（6）： 1425-1431.

[8]張中朋. 八角茴香、莽草酸生產(chǎn)市場概況[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2006，8（4）：41-42.

[9]張軍民，傅思武，石曉峰. 微生物代謝合成法在莽草酸及其衍生物研究中的應(yīng)用[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（1）：91-93.

[10]張志琴，劉光明，楊永壽，等. 云南松松針中莽草酸的含量測定[J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，21（1）：10-12.endprint

2.4 穩(wěn)定性試驗

取松針供試液，在“1.3.3”節(jié)色譜條件下，于0、4、8、12、24 h分別測定莽草酸峰面積，分別為1 645 591、1 630 190、1 655 802、1 649 043、1 638 921，計算峰面積的RSD為0769%，表明樣品供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收試驗

精確稱取已知含量的馬尾松松針粉末2.0 g，共5份，分別精確加入規(guī)定量的莽草酸標(biāo)樣，按樣品供試液制備及測定法操作，分別進行色譜分析，其平均回收率為97.621%，RSD為0.949%，符合分析要求，結(jié)果見表1。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品的預(yù)處理以及提取溶劑的選擇

據(jù)文獻報道，莽草酸隨著松針存放時間的延長而逐漸減少，可能是因為在莽草酸激酶的作用下，松針中的莽草酸經(jīng)莽草酸途徑代謝生成多種芳香族化合物，為了避免莽草酸的代謝轉(zhuǎn)化，采集的馬尾松松針樣品應(yīng)該及時烘干[10]。

莽草酸是小分子有機弱酸，易溶于水，在水中的溶解度為 180 g/L，難溶于三氯甲烷、苯和石油醚，并且水的成本較低，提取后無有害有機溶劑殘留，經(jīng)濟環(huán)保，所以采用水作為提取溶劑。

3.2 樣品中莽草酸提取工藝的優(yōu)化

精確稱取同一批馬尾松樣品干燥粉末2.5 g，對影響莽草酸提取效率的4個因素進行考察，設(shè)計4因素3水平的正交試驗，即提取時間（1.5、2、2.5 h）、提取溫度（75、85、95 ℃）、料液比（1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25）及原料粒度（40、60、80目）。試驗結(jié)果表明：提取時間為2.5 h，提取溫度為95 ℃，料液比為1 ∶ 20，粒度為60目，提取效率最高。

3.3 方法的確定與含量分析

采用HPLC法測定馬尾松樣品中莽草酸的含量，該方法準(zhǔn)確性、精確度和重復(fù)性良好，適合測定松針及其他天然植物中莽草酸的含量。由結(jié)果分析可知，馬尾松的成熟松針具有較高的開發(fā)價值，在不同樹齡的馬尾松中，數(shù)齡為10年的馬尾松適合開發(fā)利用，可以在不破壞植被的情況下最大限度地利用自然資源。

3.4 研究意義

本課題研究對資源的開發(fā)和利用提供了研究方法和應(yīng)用基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，對馬尾松生態(tài)林的建設(shè)、資源開發(fā)、生態(tài)修復(fù)提供了科學(xué)依據(jù)，對資源利用的節(jié)約化和高效利用均具有重要的綜合意義。對于松針中莽草酸的分離純化、成品制取、提取后廢料的資源再利用，本課題組正在進行進一步的深入研究。

參考文獻：

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[8]張中朋. 八角茴香、莽草酸生產(chǎn)市場概況[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2006，8（4）：41-42.

[9]張軍民，傅思武，石曉峰. 微生物代謝合成法在莽草酸及其衍生物研究中的應(yīng)用[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（1）：91-93.

[10]張志琴，劉光明，楊永壽，等. 云南松松針中莽草酸的含量測定[J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，21（1）：10-12.endprint

2.4 穩(wěn)定性試驗

取松針供試液，在“1.3.3”節(jié)色譜條件下，于0、4、8、12、24 h分別測定莽草酸峰面積，分別為1 645 591、1 630 190、1 655 802、1 649 043、1 638 921，計算峰面積的RSD為0769%，表明樣品供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收試驗

精確稱取已知含量的馬尾松松針粉末2.0 g，共5份，分別精確加入規(guī)定量的莽草酸標(biāo)樣，按樣品供試液制備及測定法操作，分別進行色譜分析，其平均回收率為97.621%，RSD為0.949%，符合分析要求，結(jié)果見表1。

3 討論與結(jié)論

3.1 樣品的預(yù)處理以及提取溶劑的選擇

據(jù)文獻報道，莽草酸隨著松針存放時間的延長而逐漸減少，可能是因為在莽草酸激酶的作用下，松針中的莽草酸經(jīng)莽草酸途徑代謝生成多種芳香族化合物，為了避免莽草酸的代謝轉(zhuǎn)化，采集的馬尾松松針樣品應(yīng)該及時烘干[10]。

莽草酸是小分子有機弱酸，易溶于水，在水中的溶解度為 180 g/L，難溶于三氯甲烷、苯和石油醚，并且水的成本較低，提取后無有害有機溶劑殘留，經(jīng)濟環(huán)保，所以采用水作為提取溶劑。

3.2 樣品中莽草酸提取工藝的優(yōu)化

精確稱取同一批馬尾松樣品干燥粉末2.5 g，對影響莽草酸提取效率的4個因素進行考察，設(shè)計4因素3水平的正交試驗，即提取時間（1.5、2、2.5 h）、提取溫度（75、85、95 ℃）、料液比（1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25）及原料粒度（40、60、80目）。試驗結(jié)果表明：提取時間為2.5 h，提取溫度為95 ℃，料液比為1 ∶ 20，粒度為60目，提取效率最高。

3.3 方法的確定與含量分析

采用HPLC法測定馬尾松樣品中莽草酸的含量，該方法準(zhǔn)確性、精確度和重復(fù)性良好，適合測定松針及其他天然植物中莽草酸的含量。由結(jié)果分析可知，馬尾松的成熟松針具有較高的開發(fā)價值，在不同樹齡的馬尾松中，數(shù)齡為10年的馬尾松適合開發(fā)利用，可以在不破壞植被的情況下最大限度地利用自然資源。

3.4 研究意義

本課題研究對資源的開發(fā)和利用提供了研究方法和應(yīng)用基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，對馬尾松生態(tài)林的建設(shè)、資源開發(fā)、生態(tài)修復(fù)提供了科學(xué)依據(jù)，對資源利用的節(jié)約化和高效利用均具有重要的綜合意義。對于松針中莽草酸的分離純化、成品制取、提取后廢料的資源再利用，本課題組正在進行進一步的深入研究。

參考文獻：

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[2]陳 英，劉成國，趙毓芝，等. 松針功能性成分及應(yīng)用研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：5994-5996.

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[4]鄭曉珂，王小蘭，馮衛(wèi)生. 松針提取物降血脂作用研究[J]. 中藥藥理與臨床，2008，24（3）：81-82.

[5]顧小文，朱開梅. 莽草酸及其衍生物醫(yī)學(xué)作用的研究進展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（6）：1099-1101.

[6]Martin E，Duke J，Pelkki M，et al. Sweetgum （Liquidambar styraciflua L.）： extraction of shikimic acid coupled to dilute acid pretreatment[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，162（6）：1660-1668.

[7]Ghosh S，Chisti Y，Banerjee U C. Production of shikimic acid[J]. Biotechnology Advances，2012，30（6）： 1425-1431.

[8]張中朋. 八角茴香、莽草酸生產(chǎn)市場概況[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2006，8（4）：41-42.

[9]張軍民，傅思武，石曉峰. 微生物代謝合成法在莽草酸及其衍生物研究中的應(yīng)用[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（1）：91-93.

[10]張志琴，劉光明，楊永壽，等. 云南松松針中莽草酸的含量測定[J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，21（1）：10-12.endprint