韓義等

摘 要：

本試驗(yàn)研究了卡那霉素（Kana）、頭孢霉素（Cef）、氨芐青霉素（Amp）、羧芐青霉素（Carb）、紅霉素（E）對(duì)刺槐形成層為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：刺槐形成層誘導(dǎo)愈傷時(shí)Cef對(duì)受體材料傷害最小，抑菌效果最好，濃度為200 mg/L時(shí)能完全抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)；用Kana作為刺槐轉(zhuǎn)基因植株的篩選，刺槐形成層愈傷組織分化時(shí)選擇劑濃度為100～125 mg/L最佳，生根培養(yǎng)時(shí)選擇劑濃度為75 mg/L最佳。

關(guān)鍵詞：刺槐；遺傳轉(zhuǎn)化；抗生素；形成層

中圖分類號(hào)：S792.270.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）04-0031-05

刺槐（Robinia pseudoacacia L.），適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快，材質(zhì)好，用途廣，繁殖容易，是人工造林的優(yōu)選樹(shù)種[1]，但其有限的耐鹽能力卻限制其栽種范圍。應(yīng)用基因工程技術(shù)提高刺槐耐鹽性是拓展其用于重鹽堿地區(qū)造林和綠化的重要途徑。我們從刺槐中克隆了定位于液泡膜的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因RpNHX1，并構(gòu)建含35S強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)載體pBI121-RpNHX1用于刺槐遺傳轉(zhuǎn)化。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化的多種技術(shù)中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法因其操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高、拷貝數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)成為常用的有效轉(zhuǎn)化方法，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化[2～6]。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，一般經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因植株再生等多個(gè)環(huán)節(jié)，除侵染和共培養(yǎng)外，其余環(huán)節(jié)都要用到抗生素作為篩選轉(zhuǎn)化體的抗性選擇劑和農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抑制劑，因此研究抗生素對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的影響是遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立的必經(jīng)環(huán)節(jié)[7，8]。不同種類抗生素抑菌效果不同，對(duì)受體材料影響也不同，因此抗生素種類選擇和劑量方案都需要在實(shí)驗(yàn)中加以確定。目前遺傳轉(zhuǎn)化中常用的抑菌類抗生素主要有頭孢霉素（Cefotaxime， Cef）、氨芐青霉素（Ampicillin， Amp）、羧芐青霉素（Carbenicillin， Carb）、紅霉素（Erythromycin， E）等。抑菌類抗生素通常用以防止遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中農(nóng)桿菌過(guò)度增殖對(duì)植物細(xì)胞造成傷害和雜菌污染。選擇抑菌類抗生素既要有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)還要最大限度減少對(duì)受體材料的影響。選擇性抗生素用于轉(zhuǎn)基因植株的篩選和檢測(cè)，這類抗生素的選擇只能根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株所攜帶的抗性基因決定，我們構(gòu)建的表達(dá)載體pBI121-RpNHX1含有編碼npt Ⅱ基因（提供卡那霉素抗性），因此本試驗(yàn)選卡那霉素（Kanamycin， Kana）用于轉(zhuǎn)基因植株的篩選和檢測(cè)。本研究的目的是確定農(nóng)桿菌介導(dǎo)RpNHX1基因在刺槐遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中抑菌劑的種類和最佳劑量方案，以及用于不同階段進(jìn)行抗性篩選的卡那霉素劑量方案，為下一步進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試刺槐為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)篩選的刺槐耐鹽優(yōu)良無(wú)性系W009，2008年定植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)試驗(yàn)站。農(nóng)桿菌菌株LBA4404含重組質(zhì)粒pBI121-RpNHX1具卡那霉素抗性，構(gòu)建于2012年4月，-70℃保存，其中載體pBI121由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)教授樊金會(huì)惠贈(zèng)。供試卡那霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、頭孢霉素、紅霉素購(gòu)于SIGMA公司。

1.2 不同抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制作用

挑取含重組質(zhì)粒的LBA4404單菌落于2 mL YEP液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)活化（28℃，200 r/min）過(guò)夜，取1 mL新鮮菌液接種于50 mL YEP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，3 000 r/min離心5 min收集菌體， 并重懸稀釋菌體至OD600值為0.6。取直徑1 cm左右刺槐莖段截成3～5 cm小段，用洗潔凈水浸泡10 min，軟毛刷清洗表面，流水沖洗2 h，在超凈工作臺(tái)上滅菌，70%酒精30 s，0.1%升汞3 min，無(wú)菌水沖洗7～8遍，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后刮去表皮，取形成層切成0.5 cm×0.5 cm小塊，形成層內(nèi)側(cè)向下貼在培養(yǎng)基表面，預(yù)培養(yǎng)24 h后，在超凈工作臺(tái)上取出于菌液中侵染10 min，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液，共培養(yǎng)3 d后接入含有抑菌類抗生素的培養(yǎng)基中。7 d觀察記錄一次，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。樣本容量為40，重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度25℃、空氣相對(duì)濕度60%、光照8 h/d、光強(qiáng)1 000 lx。

1.3 抗生素對(duì)刺槐形成層愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)

將滅菌后的外植體（材料及方法同上）接種于含不同濃度的Amp、Carb、E、Cef的誘導(dǎo)培養(yǎng)基WPM+1.2 mg/L KT+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+3%蔗糖+100 mg/L水解酪蛋白中。對(duì)照為不加抗生素。7 d觀察記錄一次，30 d后統(tǒng)計(jì)分化情況。樣本容量為40，重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度25℃、相對(duì)濕度60%、光照8 h/d、光強(qiáng)1 000 lx。

1.4 Kana對(duì)刺槐形成層愈傷組織分化的影響

將刺槐形成層誘導(dǎo)形成的愈傷組織切成0.5 cm2左右小塊接種于含不同濃度Kana的分化培養(yǎng)基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3%蔗糖+100 mg/L水解酪蛋白中。對(duì)照為不加抗生素。7 d觀察記錄一次。樣本容量為40，重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度25℃、相對(duì)濕度60%、光照14 h/d、光強(qiáng)1 500 lx。

1.5 Kana對(duì)刺槐瓶苗生根試驗(yàn)

將繼代兩次的瓶苗接種于MS空白培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)壯后，截成1～2 cm帶芽小段接種于含不同濃度Kana的生根培養(yǎng)基1/2MS+1.2 mg/L IBA+1.5%蔗糖+1.0～2.0 g/L活性炭中。7 d觀察記錄一次，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌劑的選擇及最佳抑菌濃度確定

2.1.1 抗生素Cef、Amp、Carb、E對(duì)刺槐形成層誘導(dǎo)愈傷的影響 統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，抗生素濃度在50～250 mg/L范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中抗生素濃度的升高，刺槐形成層愈傷組織誘導(dǎo)及分化率呈下降趨勢(shì)，刺槐形成層對(duì)四種抗生素敏感程度不同。四種抗生素對(duì)刺槐形成層誘導(dǎo)愈傷的抑制作用 Amp>Carb>Cef、E。Cef、E比Amp和Carb更適合做刺槐形成層誘導(dǎo)愈傷的抑菌劑（圖1）。

2.1.2 抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制作用 農(nóng)桿菌侵染過(guò)的刺槐外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，如果農(nóng)桿菌過(guò)度增殖就會(huì)對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用甚至使其變褐死亡。因此在培養(yǎng)基中加入抗生素抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)是必不可少的。試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，四種抗生素抑菌作用Cef>Amp、Carb>E。Cef抑菌效果最優(yōu)，濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)已經(jīng)完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

抑菌劑的選擇要綜合考慮其對(duì)農(nóng)桿菌的抑菌效果和對(duì)外植體的影響。分析圖1四種抗生素均會(huì)對(duì)刺槐形成層誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生抑制作用，但敏感程度不同，在低濃度下（50 mg/L）Amp和Carb對(duì)刺槐形成層誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生抑制作用，誘導(dǎo)率分別為67.5%和82.5%，低于對(duì)照（92%）；相同濃度的Cef和E對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的抑制不明顯，誘導(dǎo)率分別為92.5%和92.0%。隨著抗生素濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率均有下降，但相同濃度下添加Cef和E的愈傷組織誘導(dǎo)率要明顯高于添加Amp和Carb。在抗生素濃度為200 mg/L時(shí)培養(yǎng)基中添加Cef和E的愈傷組織誘導(dǎo)率仍維持在65%的較高水平，而相同濃度Amp和Carb愈傷組織誘導(dǎo)率分別為22.5%和42.5%。四種抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑菌效果為Cef>Amp、Carb>E，綜合考慮，Cef最適合作為刺槐形成層為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化的抑菌劑，最佳抑菌濃度為200 mg/L。

2.2 選擇劑Kana濃度的確定

2.2.1 Kana對(duì)刺槐形成層愈傷組織分化的影響 在再分化培養(yǎng)基中添加Kana能明顯抑制刺槐形成層愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽。在不添加Kana的培養(yǎng)基中，愈傷組織培養(yǎng)2周開(kāi)始分化產(chǎn)生不定芽，分化率為12.5%，培養(yǎng)5周后分化率高達(dá)87.5%（表2、圖2f）。在添加Kana 50 mg/L的培養(yǎng)基中，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織開(kāi)始出現(xiàn)變褐死亡的現(xiàn)象，培養(yǎng)5周仍有22.5%愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽。隨著Kana濃度增加，愈傷組織分化率降低，愈傷組織出現(xiàn)死亡的時(shí)間提前，死亡率升高。當(dāng)Kana濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，愈傷組織死亡率高達(dá)75.0%，分化率則降到7.5%。當(dāng)Kana濃度達(dá)到125 mg/L時(shí)，愈傷組織死亡率進(jìn)一步升高，而愈傷組織再分化已經(jīng)完全被抑制。由此可見(jiàn)，100～125 mg/L 的Kana可作為刺槐遺傳轉(zhuǎn)化形成層愈傷組織篩選較適宜的濃度。

2.2.2 Kana對(duì)刺槐瓶苗生根的影響 刺槐瓶苗生根對(duì)Kana反應(yīng)較敏感（表3），隨著Kana濃度增大，瓶苗生根率迅速降低。在不添加抗生素的培養(yǎng)基中，瓶苗生根率為100%（圖2g）。當(dāng)Kana濃度為50 mg/L時(shí)，瓶苗生根率降為22.5%，當(dāng)Kana濃度達(dá)到75 mg/L時(shí)，瓶苗生根已經(jīng)完全被抑制，從生根數(shù)量上看，隨著Kana濃度升高，瓶苗生根數(shù)量逐漸減少。由此可見(jiàn)，在刺槐轉(zhuǎn)基因植株生根時(shí)添加選擇劑75 mg/L即可達(dá)到良好的效果。

3 結(jié)論與討論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，抑菌類抗生素的選擇必須綜合考慮對(duì)農(nóng)桿菌抑制作用和對(duì)植物組織生長(zhǎng)的影響兩方面因素。目前廣泛使用的抑菌類抗生素有三類，青霉素類（氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素-G等）、頭孢霉素類（頭孢霉唑林鈉 、頭孢霉呱酮鈉 、頭孢拉定 、頭孢霉西林鈉 、頭孢霉曲松鈉等）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、白霉素等）[7]。植物對(duì)抗生素的敏感程度差別很大，不同物種間、同種植物不同品種間甚至同一株植物的不同部位做外植體時(shí)對(duì)抗生素敏感程度都不同[9]。有的研究中指出羧芐青霉素等對(duì)培養(yǎng)中的外植體有促進(jìn)作用，因其與生長(zhǎng)素2，4-D和NAA等有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)[10～13]。本研究中，刺槐形成層為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)對(duì)Cef、Carb、Amp、E四種抗生素的敏感程度為Amp>Carb>Cef、E，對(duì)農(nóng)桿菌的抑菌作用試驗(yàn)顯示四種抗生素抑菌效果為Cef>Amp、Carb>E。綜合考慮，刺槐形成層為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化中Cef對(duì)外植體的生長(zhǎng)抑制作用最小，抑菌效果最好，濃度為200 mg/L時(shí)已經(jīng)能完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，因此在后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中應(yīng)選Cef作為抑菌劑，侵染后初次使用濃度為200 mg/L，隨繼代次數(shù)增加逐漸降低使用濃度直至除去。

選擇劑能夠?qū)D(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選是通過(guò)抗生素抗性基因起作用的。本研究中選用卡那霉素作為選擇劑是因?yàn)橛糜诖袒边z傳轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒具有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT Ⅱ）標(biāo)記基因。npt Ⅱ基因編碼的產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH（3/）Ⅱ-酶）能對(duì)氨基糖苷類抗生素具有抗性[14]。Kana能夠與非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)線粒體和葉綠體結(jié)合而毒害植物綠色器官使其黃化死亡[15]。Kana濃度過(guò)高會(huì)很快殺死植物組織甚至對(duì)轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生毒害作用。不同受體材料對(duì)選擇劑敏感程度不同[16，17]，相同材料不同培養(yǎng)階段對(duì)選擇劑的敏感程度也有差異。因此在遺傳轉(zhuǎn)化之前需要設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定受體材料對(duì)選擇劑的敏感性。本研究中，刺槐形成層愈傷組織分化過(guò)程中添加Kana濃度為100～125 mg/L能起到良好的篩選作用，生根培養(yǎng)時(shí)添加Kana 75 mg/L能完全抑制不定根的產(chǎn)生。

參 考 文 獻(xiàn)：

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