劉志祥　曾超珍　周永青　譚曉風(fēng)

摘要：為闡明楊樹MIR156基因家族的進(jìn)化過程和功能分化，研究了楊樹MIR156基因家族的擴(kuò)張模式、倍增時間、系統(tǒng)發(fā)育、表達(dá)方式、啟動子元件和靶基因。結(jié)果表明：楊樹MIR156基因家族主要通過染色體大片段重復(fù)實現(xiàn)擴(kuò)張，而串聯(lián)重復(fù)對此沒有貢獻(xiàn)；不同家族成員表達(dá)方式已分化，其中ptc-MIR156g/h/i/j表達(dá)活性最高；家族成員啟動子順式作用元件存在差異；楊樹MIR156的靶基因包括29個SBP結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，由于成熟序列存在差異，家族成員調(diào)控的靶基因也表現(xiàn)出差異。說明楊樹MIR156基因家族成員的功能已經(jīng)分化，在楊樹中可能形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

關(guān)鍵詞：楊樹；microRNA；MIR156基因家族；分子進(jìn)化；功能分化

中圖分類號： Q943文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0026-04

收稿日期：2013-08-13

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金（編號：13JJ3095）；中南林業(yè)科技大學(xué)青年基金（編號：QJ2011042B）。

作者簡介：劉志祥（1978—），男，湖南湘陰人，博士研究生，講師，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究。E-mail：liuzx0927@foxmail.com。

通信作者：譚曉風(fēng)，博士，教授，主要從事林業(yè)生物技術(shù)研究。Tel：（0731）85623406；E-mail：tanxiaofengcn@126.com。楊樹是全球范圍內(nèi)廣泛栽培的速生豐產(chǎn)用材樹種和生物質(zhì)能源樹種，具有重要經(jīng)濟(jì)價值，同時在生態(tài)環(huán)境保護(hù)中也具有重要價值[1]。自毛果楊（Populus trichocarpa）基因組完成測序后[2]，楊樹作為一個重要的模式系統(tǒng)廣泛用于木材形成、周期性生長、適應(yīng)性等方面的研究[3]。

植物微RNA（microRNA，miRNA）是一類具有調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。miRNA由基因組編碼，通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，通過DCL等蛋白的剪切加工形成長約21 nt的成熟序列，并在多種蛋白質(zhì)的參與下識別與其序列互補的靶mRNA并介導(dǎo)其翻譯抑制或剪切，從而實現(xiàn)對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。由于miRNA的靶基因往往是具有調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄因子等，所以miRNA對植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答具有十分重要的調(diào)控功能，在植物分子育種中具有良好的應(yīng)用前景[4]。

MIR156是一個古老的miRNA基因家族，對植物生長發(fā)育具有非常重要的調(diào)控作用，如赤霉素途徑[5]、育性[6]、發(fā)育階段轉(zhuǎn)變[7-8]、葉原基間隔長度與器官形態(tài)[9]等。已有的研究主要以擬南芥（Arabidopsis thaliana）為材料，而MIR156在木本植物中的功能尚未見報道。本研究通過對楊樹MIR156基因家族的擴(kuò)張模式、倍增時間、系統(tǒng)發(fā)育、表達(dá)方式、啟動子元件和靶基因的研究，初步闡明楊樹MIR156基因家族的進(jìn)化過程和功能分化，以期為楊樹MIR156基因的功能研究以及在分子育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1基因組定位與基因倍增模式分析

從miRBase數(shù)據(jù)庫（www.mirbase.org，Release 19）中獲取ptc-MIR156基因家族序列和在楊樹基因組JGI_Poptr 2.0中的坐標(biāo)，以FASTA格式將楊樹基因組數(shù)據(jù)提交給Phytozome數(shù)據(jù)庫（www.phytozome.net），經(jīng)BLAST比對獲取其在楊樹基因組JGI_Poptr 3.0上的坐標(biāo)。采用Maher等的方法[10]對楊樹基因組數(shù)據(jù)（JGI_Poptr 3.0）進(jìn)行基因家族擴(kuò)張模式分析，包括串聯(lián)重復(fù)和染色體大片段重復(fù)。

1.2基因倍增時間估算

對倍增塊中保守的蛋白質(zhì)編碼基因采用Clustal X進(jìn)行氨基酸序列比對，然后以氨基酸序列比對結(jié)果為參照，進(jìn)行編碼序列比對，使用KaKs_Calculator計算序列間同義替換率[Ks（次/個）]；Ks=替換次數(shù)/同義替換位點個數(shù)，算法選擇YN法。求得Ks平均值以用于計算倍增時間，計算公式為：D=Ks/（2E）。式中：D表示時間（年），[次/（個·年）]；E[E=替換次數(shù)/（同義替換位點個數(shù)×?xí)r間）]表示分子替換速率。楊樹分子進(jìn)化速率約為擬南芥的1/6[2]，在擬南芥中 E=1.5×10-8次/（個·年）[11]，所以楊樹E取2.5×10-9次/（個·年）。

1.3分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將楊樹MIR1156基因家族序列進(jìn)行MUSCLE比對，比對結(jié)果輸入到MEGA5軟件中，分別采用最大似然法和鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用自展法檢驗進(jìn)化樹，重復(fù)值設(shè)置為 1 000。

1.4啟動子順式作用元件分析

參考Cui等的方法[12]，從Phytozome數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net，JGI_Poptr 3.0）中獲取ptc-MIR156基因家族上游啟動子序列。將所獲取的序列提交給PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），分析其中的順式作用元件。

1.5表達(dá)分析

從毛果楊小RNA高通量測序結(jié)果[13]中提取MIR156基因家族成員原始測序讀數(shù)，并進(jìn)行均一化處理計算表達(dá)量：表達(dá)量=原始讀數(shù)/與基因組匹配的總讀數(shù)×106。

1.6靶基因分析

楊樹MIR156基因家族靶基因預(yù)測采用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/#），將miRNA成熟序列提交給psRNATarget，靶基因搜索范圍設(shè)置為Populus trichocarpa transcript（phytozome v8.0，genome V3.0，internal number 210），參數(shù)為默認(rèn)值。

2結(jié)果與分析

2.1基因組定位與基因倍增模式分析

通過查詢miRBase和Phytozome數(shù)據(jù)庫獲取楊樹MIR156基因家族在楊樹基因組中的位置信息（表1）。楊樹MIR156基因家族共有12個成員，除ptc-MIR156h在JGI_Poptr 3.0中未找到定位，其余11個成員均在JGI_Poptr 3.0找到了位置。從定位情況可知，楊樹MIR156基因家族成員在基因組上均為分散分布，未見成簇分布，說明楊樹MIR156基因家族成員間沒有串聯(lián)重復(fù)關(guān)系。表1楊樹MIR156基因家族成員的基因組定位情況

MIR156基因家庭成員1基因組定位（JGI_Poptr2.0）1基因組定位（JGI_Poptr3.0）1證據(jù)ptc-MIR156h1scaffold_4：7938832-7938934[-]1—1克隆[2，14-15]ptc-MIR156l1scaffold_1：34445840-34445933[-]1Chr01：34292488-34292581[+]1小RNA深度測序[13]ptc-MIR156a1scaffold_6：19089414-19089514[-]1Chr06：20084161-20084261[-]1與ath-MIR156b序列相似[2]ptc-MIR156b1scaffold_6：22869899-22869999[-]1Chr06：23735954-23736054[-]1與ath-MIR156f序列相似[2，15]ptc-MIR156c1scaffold_6：25766668-25766767[+]1Chr06：26631525-26631624[+]1與ath-MIR156a序列相似[2]ptc-MIR156k1scaffold_11：11956115-11956215[-]1Chr11：11382228-11382328[-]1與ath-MIR156a序列相似[2]ptc-MIR156i1scaffold_12：4332062-4332160[-]1Chr12：4939241-4939339[+]1克隆[2，14-15]ptc-MIR156j1scaffold_15：4013699-4013798[+]1Chr15：4227002-4227101[-]1克隆[2，14-15]ptc-MIR156g1scaffold_5：11875533-11875635[-]1Chr17：13418464-13418566[+]1克隆[2，14-15]ptc-MIR156f1scaffold_18：12448484-12448584[-]1Chr18：13566875-13566975[-]1與ath-MIR156b序列相似[2]ptc-MIR156e1scaffold_18：2189691-2189790[+]1Chr18：1583358-1583457[-]1與ptc-MIR156j 序列相似[2，14]ptc-MIR156d1scaffold_18：8350103-8350203[+]1scaffold_28：190974-191074[+]1與ptc-MIR156g序列相似[2，14-15]

通過分析各成員的側(cè)翼保守蛋白質(zhì)基因，共發(fā)現(xiàn)5對基因為染色體大片段重復(fù)的產(chǎn)物，對其中側(cè)翼保守蛋白質(zhì)基因數(shù)量大于4的倍增基因?qū)M(jìn)行了倍增時間估算，結(jié)果見表2。表2顯示，產(chǎn)生倍增基因?qū)tc-MIR156a與ptc-MIR156f、ptc-MIR156c 與ptc-MIR156e的染色體大片段重復(fù)發(fā)生的時間分別約在4 598萬、5 605萬年前，這一時間與楊樹進(jìn)化過程中最近所經(jīng)歷的一次全基因組重復(fù)——楊柳科重復(fù)在時間上較接近。表2染色體大片段重復(fù)及其時間估算

倍增基因11倍增基因21保守側(cè)翼蛋白質(zhì)基因?qū)?shù)1平均Ks1Ks標(biāo)準(zhǔn)差1倍增時間（萬年）ptc-MIR156a1ptc-MIR156f1910.280 256 44410.096 534 03515 605ptc-MIR156c1ptc-MIR156e1910.229 8821 1110.034 782 32814 598ptc-MIR156i1ptc-MIR156j121—1—1—ptc-MIR156a1ptc-MIR156e111—1—1—ptc-MIR156g1ptc-MIR156l111—1—1—

由此可見，楊樹MIR156基因家族主要通過染色體大片段重復(fù)實現(xiàn)基因家族的擴(kuò)張，而串聯(lián)重復(fù)對楊樹MIR156基因家族的擴(kuò)張并沒有貢獻(xiàn)。

2.2分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

分別采用鄰接法和最大似然法構(gòu)建楊樹MIR156基因家族的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，這2種方法所建進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)相似，且大部分節(jié)點的Bootstrap值大于70，說明所建分子系統(tǒng)發(fā)育樹是可靠的，其中鄰接樹如圖1所示。將分子系統(tǒng)發(fā)育樹與基因倍增模式分析結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過染色體大片段重復(fù)所產(chǎn)生的重復(fù)基因如ptc-MIR156a與ptc-MIR156f、ptc-MIR156c與ptc-MIR156e、ptc-MIR156i與ptc-MIR156j在進(jìn)化樹上位于分支末端，說明這些染色體大片段重復(fù)導(dǎo)致的基因家族擴(kuò)張是楊樹MIR156基因家族進(jìn)化過程中較晚的事件；ptc-MIR156b與ptc-MIR156d、ptc-MIR156g與ptc-MIR156h在進(jìn)化樹中位于分支末端，但它們不是串聯(lián)重復(fù)和染色體大片段重復(fù)的產(chǎn)物，說明它們可能是通過轉(zhuǎn)座等其他方式進(jìn)行擴(kuò)張的產(chǎn)物[16]。

2.3表達(dá)分析

基于小RNA高通量測序的表達(dá)分析結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，在葉片、木質(zhì)部、機(jī)械脅迫木質(zhì)部和混合組織（包括營養(yǎng)生長莖尖、雄花、雌花、雌株頂芽、雄株頂芽和側(cè)芽）中，ptc-MIR156g/h/i/j表達(dá)活性最高，其次是ptc-MIR156a/b/c/d/e/f，ptc-MIR156k與ptc-MIR156l表達(dá)活性均很低，在混合組織中甚至沒有檢測到。

楊樹MIR156基因家族在葉片和木質(zhì)部中表達(dá)活性較高，而在以花和芽組成的混合組織中表達(dá)活性較低。另外，楊樹MIR156基因家族各成員中的表達(dá)水平在不同組織中呈現(xiàn)出多樣性，說明不同成員的表達(dá)方式已經(jīng)分化。

2.4啟動子順式作用元件分析

采用PlantCARE分析楊樹MIR156家族11個成員上游啟動子所含的順式作用元件，部分元件如表2所示。結(jié)果（表3）顯示，家族成員上游均具有CAAT-box、TATA-box等基本元件，可能都具有轉(zhuǎn)錄活性。同時，在不同成員上游發(fā)現(xiàn)了多個與激素調(diào)控、脅迫響應(yīng)及光響應(yīng)相關(guān)的元件，說明MIR156可能參與這些過程的調(diào)控。表3還顯示，不同成員的上游元件存在差異，而這將導(dǎo)致不同成員的表達(dá)存在時空差異。

2.5靶基因分析

將楊樹MIR156基因家族的成熟序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖3所示，12個家族成員產(chǎn)生的成熟序列只有4種，分別為ptc-MIR156a/b/c/d/e/f、ptc-MIR156g/h/i/j、ptc-MIR156k和ptc-MIR156l。4種成熟序列存在差異，可能導(dǎo)致其識別的靶基因有所差異。

通過psRNATarget預(yù)測分析共找到楊樹MIR156的靶基因29個，均為SQUAMOSA啟動子結(jié)合蛋白（SQUAMOSA promoter binding protein，SBP）。SBP是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，對植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控功能，如花與果實發(fā)育、赤霉素途徑、銅應(yīng)答過程等[17]。但由于成熟序列存在差異，導(dǎo)致不同成員的靶基因存在一定差異（圖4）。其中20個基因是全部成員的預(yù)測靶基因，而ptc-MIR156a/b/c/d/e/f和ptc-MIR156k分別獨有2個靶基因。這說明由于楊樹MIR156基因家族成員間成熟序列的差異，可能導(dǎo)致它們調(diào)控的靶基因也已經(jīng)出現(xiàn)了差異，即不同成員間已出現(xiàn)了功能分化。

3結(jié)論

miRNA通過靶基因的反向重復(fù)或隨機(jī)序列而起源，通過染色體片段重復(fù)或串聯(lián)重復(fù)實現(xiàn)家族擴(kuò)張[16，18]。擴(kuò)張模式分析結(jié)果表明，楊樹MIR156基因家族主要通過染色體大片段重復(fù)實現(xiàn)擴(kuò)增，而串聯(lián)重復(fù)對此沒有貢獻(xiàn)?；趍iRNA深度測序的表達(dá)分析結(jié)果表明，楊樹MIR156基因家族成員的表達(dá)方式已經(jīng)分化，而且不同成員的上游順式作用元件及調(diào)控的靶基因也表現(xiàn)出差異，說明家族成員間功能已經(jīng)分化，MIR156基因家族在楊樹中可能已經(jīng)形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與不同生命活動的調(diào)控。楊樹為多年生木本植物，其生長發(fā)育與擬南芥等一年生或二年生植物差異顯著，所以進(jìn)一步研究MIR156及其靶基因SBP轉(zhuǎn)錄因子對楊樹生長發(fā)育的調(diào)控具有重要意義。

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