喬新榮　趙麗平　孫偉　徐長(zhǎng)水

摘要：采用PCR技術(shù)擴(kuò)增擬南芥PHOT2基因編碼序列，并將其轉(zhuǎn)入pSUPER1300超表達(dá)載體中，構(gòu)建了 pSUPER1300-PHOT2 超表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)入擬南芥野生型gl1、phot1突變體中。PCR擴(kuò)增及 RT-PCR 分析表明，該基因超表達(dá)，篩選到了潛在的轉(zhuǎn)基因株系。

關(guān)鍵詞：藍(lán)光受體；向光素；超表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q943.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0030-02

收稿日期：2013-06-08

作者簡(jiǎn)介：?jiǎn)绦聵s（1972—），女，河南新密人，博士，講師，主要從事植物生理及分子生物學(xué)研究。E-mail：xinrong806@163.com。光向素（phototropin，PHOT）是植物特有的藍(lán)光受體，PHOT1、PHOT2屬于同一家族，其N端含有2個(gè)高度保守的光感受區(qū)LOV1（light，oxygen，voltage1）區(qū)、LOV2區(qū)，每個(gè)LOV區(qū)都結(jié)合一分子的黃素單核苷酸（FMN）作為發(fā)色團(tuán)。C端是Ser/Thr蛋白激酶區(qū)，藍(lán)光激活多個(gè)絲氨酸殘基發(fā)生自磷酸化作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PHOT1的第851位絲氨酸殘基（Ser851）的磷酸化作用是PHOT1發(fā)揮其生理作用所必需的[2]。PHOT都定位于質(zhì)膜，但藍(lán)光會(huì)誘導(dǎo)部分PHOT1向胞質(zhì)遷移，部分PHOT2移至高爾基體及葉綠體外膜[3-5]。PHOT1、PHOT2調(diào)節(jié)植物的許多生理反應(yīng)，包括植物的向光反應(yīng)、氣孔開放、葉綠體遷移及提高弱光下植物的光合作用、降低強(qiáng)光對(duì)植物傷害等[1，6]。目前，學(xué)者們對(duì)PHOT1、PHOT2的結(jié)構(gòu)及其生理作用有了較為深入的研究[7-8]，PHOT1、PHOT2以光強(qiáng)依賴方式共同介導(dǎo)植物的許多生理反應(yīng)，如共同介導(dǎo)弱光下葉綠體的聚集運(yùn)動(dòng)及強(qiáng)光下下胚軸的向光彎曲[7]。為了進(jìn)一步研究PHOT2基因的功能及該基因下游的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建pSUPER1300-PHOT2超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入野生型gl1及phot1突變體2種遺傳背景材料，獲得PHOT2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，旨在為深入研究PHOT1、PHOT2所調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)提供遺傳材料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料擬南芥野生型gl1（Col-0生態(tài)型）、phot1突變體。

1.1.2試劑、菌株、載體大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101、超表達(dá)載體pSUPER1300、TaqDNA聚合酶為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T 、限制性內(nèi)切酶、Oligo（dT）引物、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)（marker）、DNA凝膠純化回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司；Trizol試劑購自 Invitrogen 公司；高效連接試劑盒Soultion I、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、潮霉素B（hygromycin B）購自Promega公司；KOD-plus DNA 聚合酶購自ToYoBo公司；各類抗生素購自Solarbio公司；dNTP、普通PCR buffer購自天根生化科技有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（以下簡(jiǎn)稱上海生工）合成（表1）。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成將野生型gl1種子點(diǎn)播于0.6% MS固體培養(yǎng)基上，取生長(zhǎng)2周左右的無菌苗0.1 g，液氮研磨，按照Trizol試劑說明書提取總RNA 。將提取的總RNA在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。以合格的總RNA 為模板，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 第一鏈，立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2AtPHOT2超表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)TAIR網(wǎng)站上提供的AtPHOT1的CDS序列及pSUPER1300載體上的多克隆位點(diǎn)，選擇XbaⅠ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶，設(shè)計(jì)克隆引物PF1、PR1。以cDNA為模板，利用普通TaqDNA聚合酶預(yù)擴(kuò)增預(yù)期片段，再用高保真酶KOD-PlusDNA聚合酶擴(kuò)增回收。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃復(fù)性40 s，68 ℃ 延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。依據(jù)TA克隆試劑盒說明書將上述PCR 產(chǎn)物克隆到pMD18-T Vector，然后通過熱激法將連接產(chǎn)物傳入大腸桿菌DH5α中，并在含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)。菌落PCR、質(zhì)粒PCR后，得到重組克隆pMD18-PHOT2質(zhì)粒，送上海生工測(cè)序。以測(cè)序正確的pMD18-PHOT2質(zhì)粒為模板，按上述引物、PCR程序再進(jìn)行PHOT2片段擴(kuò)增，回收片段、pSUPER1300 空質(zhì)粒分別利用XbaⅠ、KpnⅠ酶切，連接并轉(zhuǎn)化，進(jìn)行PCR檢測(cè)、酶切鑒定，送上海生工測(cè)序，得到pSUPER1300-PHOT2超表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化采用CaCl2凍融法將0.5 μL重組質(zhì)粒pSUPER13000-PHOT2導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，涂板篩選，挑選單菌落搖菌，以所搖農(nóng)桿菌菌液為模板，PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽性目的質(zhì)粒。擬南芥轉(zhuǎn)化采用的方法是花序浸染法[9]，將含有陽性超表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液分別浸染野生型gl1、phot1突變體的花序，收獲轉(zhuǎn)化后的種子，用潮霉素B（Hyg B）進(jìn)行抗性篩選，得T1代轉(zhuǎn)基因植株，用SDS法提取葉片DNA，利用PF2、PR2引物擴(kuò)增PHOT2基因，對(duì)能擴(kuò)增出目的條帶的株系繼續(xù)進(jìn)行Hyg B抗性篩選，直至T3代產(chǎn)生純合株系。

1.2.4表達(dá)量鑒定把PHOT2基因轉(zhuǎn)入gl1背景的株系命名為PHOT2-OX，將以phot1突變體為背景的PHOT2超表達(dá)株系命名為phot1PHOT2-OX。用Trizol法提取擬南芥gl1、phot1及上述2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系幼苗的總RNA，利用ACTIN2基因做內(nèi)參，用PF2、PR2引物對(duì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PHOT2表達(dá)量的半定量PCR鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1PHOT1基因超表達(dá)載體的構(gòu)建

用Trizol方法提取擬南芥幼苗，用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增到2 748 bp的PHOT2的CDS序列全長(zhǎng)（圖1）。由于該基因CDS片段較長(zhǎng)，PCR不易擴(kuò)增，為了保證載體構(gòu)建時(shí)有足夠的模板，先將回收的片段與易連接轉(zhuǎn)化的克隆載體pMD18-T相連，將得到的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)。通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定基因片段正確后，取20 μL質(zhì)粒測(cè)序，序列比對(duì)完全正確，可用于表達(dá)載體構(gòu)建的模板。用測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，PCR目的條帶回收，與pSUPER1300空載體用XbaⅠ、KpnⅠ酶同時(shí)酶切4 h回收，Soultion Ⅰ連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)。菌落PCR驗(yàn)證正確后，挑單菌落進(jìn)行過夜液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR鑒定條帶正確后，再酶切驗(yàn)證（圖2）。將得到的pSUPER1300-PHOT2重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)，序列片段與擬南芥資源信息（TAIR）網(wǎng)站上公布的序列完全相同。

2.2PHOT2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的初步鑒定

將測(cè)序正確的pSUPER1300-PHOT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，菌液PCR鑒定出目的條帶。將獲得的pSUPER1300-PHOT2農(nóng)桿菌菌株分別浸染擬南芥野生型gl1、phot1突變體植株，篩選轉(zhuǎn)基因株系。取部分T3代純合株系生長(zhǎng)2～3周的葉片，提取基因組DNA進(jìn)行初步篩選鑒定，設(shè)計(jì)PHOT2引物PF2、PR2進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖3），檢測(cè)了5株P(guān)HOT2轉(zhuǎn)入野生型gl1所獲得的轉(zhuǎn)基因株系（命名為PHOT2-OX），即圖3所示的1～5號(hào)泳道，除5號(hào)株系有微弱條帶外，其余均擴(kuò)增出了較亮的電泳條帶，與預(yù)期條帶一致。6～11號(hào)是以phot1突變體為背景的PHOT2超表達(dá)株系（命名為phot1PHOT2-OX），7號(hào)株系沒有目的條帶，其他5個(gè)株系檢測(cè)到了目的條帶。

2.3PHOT2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量的鑒定

提取圖3中有目的條帶的轉(zhuǎn)基因單株的總RNA，同時(shí)提取野生型gl1及phot1突變體幼苗的總RNA做對(duì)照。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行半定量RT-PCR鑒定，檢測(cè)各個(gè)株系PHOT2的表達(dá)情況。以ACTIN2為內(nèi)參，設(shè)計(jì)表1所示的AF1、AR1為對(duì)照引物，PHOT2半定量表達(dá)引物為PF2、PR2，進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖4）。PHOT2-OX轉(zhuǎn)基因株系2、3表達(dá)量明顯高于對(duì)照gl1。phot1PHOT2-OX株系10、11號(hào)表達(dá)量顯著高于對(duì)照phot1突變體（圖5）。由此可知，篩選到了潛在的轉(zhuǎn)基因植株。

3結(jié)論與討論

光不僅是植物生長(zhǎng)發(fā)育的能量來源，而且也是一種重要的信號(hào)分子。利用不同類型的遺傳突變體材料是目前研究基因功能的重要手段。PHOT1、PHOT2既共同介導(dǎo)了植物的許多生理反應(yīng)，又有其獨(dú)特的功能。本研究利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增擬南芥PHOT2基因，結(jié)果表明，該基因CDS序列全長(zhǎng)為2 748 bp，與已發(fā)表的PHOT2序列完全相同。將目的基因插入到表達(dá)載體pSUPER1300中的35S啟動(dòng)子下游，成功構(gòu)建了超表達(dá)質(zhì)粒pSUPER1300-PHOT2，獲得了野生型gl1、phot1突變體2種背景的PHOT2超表達(dá)遺傳材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]Christie J M. Phototropin blue-light receptors[J]. Annual Review of Plant Biology，2007，58：21-45.

[2]Inoue S，Kinoshita T，Matsumoto M，et al. Blue light-induced autophosphorylation of phototropin is a primary step for signaling[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（14）：5626-5631.

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[4]Kong S G，Suetsugu N，Kikuchi S，et al. Both phototropin 1 and 2 localize on the chloroplast outer membrane with distinct localization activity[J]. Plant & Cell Physiology，2013，54（1）：80-92.

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[6]Takemiya A，Inoue S，Doi M，et al. Phototropins promote plant growth in response to blue light in low light environments[J]. Plant Cell，2005，17（4）：1120-1127.

[7]Sakai T，Kagawa T，Kasahara M，et al. Arabidopsis nph1 and npl1：blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（12）：6969-6974.

[8]Kagawa T，Sakai T，Suetsugu N，et al. Arabidopsis NPL1：a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response[J]. Science，2001，291（5511）：2138-2141.

[9]Clough S J，Bent A F. Floral Dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，1998，16（6）：735-743.趙會(huì)彥，肖麓，杜德志. 青海大黃油菜黃籽基因SSR標(biāo)記開發(fā)和圖譜構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：32-35.

2結(jié)果與分析

2.1PHOT1基因超表達(dá)載體的構(gòu)建

用Trizol方法提取擬南芥幼苗，用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增到2 748 bp的PHOT2的CDS序列全長(zhǎng)（圖1）。由于該基因CDS片段較長(zhǎng)，PCR不易擴(kuò)增，為了保證載體構(gòu)建時(shí)有足夠的模板，先將回收的片段與易連接轉(zhuǎn)化的克隆載體pMD18-T相連，將得到的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)。通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定基因片段正確后，取20 μL質(zhì)粒測(cè)序，序列比對(duì)完全正確，可用于表達(dá)載體構(gòu)建的模板。用測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，PCR目的條帶回收，與pSUPER1300空載體用XbaⅠ、KpnⅠ酶同時(shí)酶切4 h回收，Soultion Ⅰ連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)。菌落PCR驗(yàn)證正確后，挑單菌落進(jìn)行過夜液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR鑒定條帶正確后，再酶切驗(yàn)證（圖2）。將得到的pSUPER1300-PHOT2重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)，序列片段與擬南芥資源信息（TAIR）網(wǎng)站上公布的序列完全相同。

2.2PHOT2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的初步鑒定

將測(cè)序正確的pSUPER1300-PHOT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，菌液PCR鑒定出目的條帶。將獲得的pSUPER1300-PHOT2農(nóng)桿菌菌株分別浸染擬南芥野生型gl1、phot1突變體植株，篩選轉(zhuǎn)基因株系。取部分T3代純合株系生長(zhǎng)2～3周的葉片，提取基因組DNA進(jìn)行初步篩選鑒定，設(shè)計(jì)PHOT2引物PF2、PR2進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖3），檢測(cè)了5株P(guān)HOT2轉(zhuǎn)入野生型gl1所獲得的轉(zhuǎn)基因株系（命名為PHOT2-OX），即圖3所示的1～5號(hào)泳道，除5號(hào)株系有微弱條帶外，其余均擴(kuò)增出了較亮的電泳條帶，與預(yù)期條帶一致。6～11號(hào)是以phot1突變體為背景的PHOT2超表達(dá)株系（命名為phot1PHOT2-OX），7號(hào)株系沒有目的條帶，其他5個(gè)株系檢測(cè)到了目的條帶。

2.3PHOT2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量的鑒定

提取圖3中有目的條帶的轉(zhuǎn)基因單株的總RNA，同時(shí)提取野生型gl1及phot1突變體幼苗的總RNA做對(duì)照。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行半定量RT-PCR鑒定，檢測(cè)各個(gè)株系PHOT2的表達(dá)情況。以ACTIN2為內(nèi)參，設(shè)計(jì)表1所示的AF1、AR1為對(duì)照引物，PHOT2半定量表達(dá)引物為PF2、PR2，進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖4）。PHOT2-OX轉(zhuǎn)基因株系2、3表達(dá)量明顯高于對(duì)照gl1。phot1PHOT2-OX株系10、11號(hào)表達(dá)量顯著高于對(duì)照phot1突變體（圖5）。由此可知，篩選到了潛在的轉(zhuǎn)基因植株。

3結(jié)論與討論

光不僅是植物生長(zhǎng)發(fā)育的能量來源，而且也是一種重要的信號(hào)分子。利用不同類型的遺傳突變體材料是目前研究基因功能的重要手段。PHOT1、PHOT2既共同介導(dǎo)了植物的許多生理反應(yīng)，又有其獨(dú)特的功能。本研究利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增擬南芥PHOT2基因，結(jié)果表明，該基因CDS序列全長(zhǎng)為2 748 bp，與已發(fā)表的PHOT2序列完全相同。將目的基因插入到表達(dá)載體pSUPER1300中的35S啟動(dòng)子下游，成功構(gòu)建了超表達(dá)質(zhì)粒pSUPER1300-PHOT2，獲得了野生型gl1、phot1突變體2種背景的PHOT2超表達(dá)遺傳材料。

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[5]Kong S G，Suzuki T，Tamura K，et al. Blue light-induced association of phototropin 2 with the Golgi apparatus[J]. Plant Journal，2006，45（6）：994-1005.

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[7]Sakai T，Kagawa T，Kasahara M，et al. Arabidopsis nph1 and npl1：blue light receptors that mediate both phototropism and chloroplast relocation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（12）：6969-6974.

[8]Kagawa T，Sakai T，Suetsugu N，et al. Arabidopsis NPL1：a phototropin homolog controlling the chloroplast high-light avoidance response[J]. Science，2001，291（5511）：2138-2141.

[9]Clough S J，Bent A F. Floral Dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal，1998，16（6）：735-743.趙會(huì)彥，肖麓，杜德志. 青海大黃油菜黃籽基因SSR標(biāo)記開發(fā)和圖譜構(gòu)建[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：32-35.

2結(jié)果與分析

2.1PHOT1基因超表達(dá)載體的構(gòu)建

用Trizol方法提取擬南芥幼苗，用反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增到2 748 bp的PHOT2的CDS序列全長(zhǎng)（圖1）。由于該基因CDS片段較長(zhǎng)，PCR不易擴(kuò)增，為了保證載體構(gòu)建時(shí)有足夠的模板，先將回收的片段與易連接轉(zhuǎn)化的克隆載體pMD18-T相連，將得到的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)。通過菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定基因片段正確后，取20 μL質(zhì)粒測(cè)序，序列比對(duì)完全正確，可用于表達(dá)載體構(gòu)建的模板。用測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，PCR目的條帶回收，與pSUPER1300空載體用XbaⅠ、KpnⅠ酶同時(shí)酶切4 h回收，Soultion Ⅰ連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)。菌落PCR驗(yàn)證正確后，挑單菌落進(jìn)行過夜液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR鑒定條帶正確后，再酶切驗(yàn)證（圖2）。將得到的pSUPER1300-PHOT2重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)，序列片段與擬南芥資源信息（TAIR）網(wǎng)站上公布的序列完全相同。

2.2PHOT2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的初步鑒定

將測(cè)序正確的pSUPER1300-PHOT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，菌液PCR鑒定出目的條帶。將獲得的pSUPER1300-PHOT2農(nóng)桿菌菌株分別浸染擬南芥野生型gl1、phot1突變體植株，篩選轉(zhuǎn)基因株系。取部分T3代純合株系生長(zhǎng)2～3周的葉片，提取基因組DNA進(jìn)行初步篩選鑒定，設(shè)計(jì)PHOT2引物PF2、PR2進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖3），檢測(cè)了5株P(guān)HOT2轉(zhuǎn)入野生型gl1所獲得的轉(zhuǎn)基因株系（命名為PHOT2-OX），即圖3所示的1～5號(hào)泳道，除5號(hào)株系有微弱條帶外，其余均擴(kuò)增出了較亮的電泳條帶，與預(yù)期條帶一致。6～11號(hào)是以phot1突變體為背景的PHOT2超表達(dá)株系（命名為phot1PHOT2-OX），7號(hào)株系沒有目的條帶，其他5個(gè)株系檢測(cè)到了目的條帶。

2.3PHOT2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量的鑒定

提取圖3中有目的條帶的轉(zhuǎn)基因單株的總RNA，同時(shí)提取野生型gl1及phot1突變體幼苗的總RNA做對(duì)照。反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行半定量RT-PCR鑒定，檢測(cè)各個(gè)株系PHOT2的表達(dá)情況。以ACTIN2為內(nèi)參，設(shè)計(jì)表1所示的AF1、AR1為對(duì)照引物，PHOT2半定量表達(dá)引物為PF2、PR2，進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖4）。PHOT2-OX轉(zhuǎn)基因株系2、3表達(dá)量明顯高于對(duì)照gl1。phot1PHOT2-OX株系10、11號(hào)表達(dá)量顯著高于對(duì)照phot1突變體（圖5）。由此可知，篩選到了潛在的轉(zhuǎn)基因植株。

3結(jié)論與討論

光不僅是植物生長(zhǎng)發(fā)育的能量來源，而且也是一種重要的信號(hào)分子。利用不同類型的遺傳突變體材料是目前研究基因功能的重要手段。PHOT1、PHOT2既共同介導(dǎo)了植物的許多生理反應(yīng)，又有其獨(dú)特的功能。本研究利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增擬南芥PHOT2基因，結(jié)果表明，該基因CDS序列全長(zhǎng)為2 748 bp，與已發(fā)表的PHOT2序列完全相同。將目的基因插入到表達(dá)載體pSUPER1300中的35S啟動(dòng)子下游，成功構(gòu)建了超表達(dá)質(zhì)粒pSUPER1300-PHOT2，獲得了野生型gl1、phot1突變體2種背景的PHOT2超表達(dá)遺傳材料。

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