胞漿輕鏈測定在多發(fā)性骨髓瘤的微小殘留病變檢測中的價值

趙英男，朱 杰

胞漿輕鏈測定在多發(fā)性骨髓瘤的微小殘留病變檢測中的價值

趙英男1，朱 杰2

目的探討胞漿輕鏈檢測在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)檢測的價值。方法采用四色流式細胞術(shù)，用CD45-APC/SSC及CD38/CD56/CD19及CD138聯(lián)合設(shè)門，通過檢測胞漿內(nèi)輕鏈(cκ鏈、cλ鏈)對45 例經(jīng)治療后已完全緩解MM患者(治療前已經(jīng)過上述免疫分型檢測)的骨髓標本進行微小殘留病變的檢測，同時進行跟蹤隨訪，分析MRD對MM患者的復(fù)發(fā)率和無病生存時間是否存在影響。結(jié)果45例骨髓瘤患者中分泌型為37例(其中IgG型為27例，IgA型為10例)，輕鏈型為5例(λ鏈型4例，κ鏈型1例)，不分泌型3例。表型為CD38+CD56+CD19-CD45-出現(xiàn)的頻率為，分泌型中100% (37/37)，輕鏈型20%(1/5)，不分泌型0%(0/3)；表型為CD38+CD56-CD19-CD45-為，輕鏈型80%(4/5)，不分泌型100%(3/3)。CD138+，100%(45/45)；胞漿輕鏈(cκ鏈、cλ鏈)，100%(45/45)，其中分泌型：cκ鏈27%(10/37)；cλ鏈：73%(27/37)；輕鏈型：cκ鏈20%(1/5)，cλ鏈：80%(4/5)；不分泌型：cκ鏈33%(1/3)，cλ鏈：67%(2/3)，經(jīng)治療緩解后進行MRD檢測，免疫表型為CD38+CD56+CD138+CD19-CD45-MRD陽性率為18%(7/38)，免疫表型為CD38+CD56-CD138+CD19-CD45-MRD陽性率為100%(7/7),兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，cκ鏈組MRD陽性率為25%(3/12)，cλ鏈組33%(11/33)，兩組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義。隨訪24個月后，MRD陰性組復(fù)發(fā)率13%(4/31)，MDR陽性組復(fù)發(fā)率為71%(10/14)，兩組復(fù)發(fā)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MRD陰性組累積無病生存時間中位數(shù)15.53(9.35～21.62)個月，明顯長于MRD陽性組的9.75(3.69～14.24)個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論胞漿輕鏈測定在多發(fā)性骨髓瘤的微小殘留病變檢測中可以作為臨床判斷預(yù)后的重要指標，并對臨床開展相關(guān)治療有指導(dǎo)意義。

多發(fā)性骨髓瘤；免疫表型；胞漿輕鏈；流式細胞術(shù)；微小殘留病變

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是以克隆性惡性漿細胞(骨髓瘤細胞)在骨髓中異常增殖，并伴有單克隆免疫球蛋白(monoclonal immunoglobulin)增多為特征的疾病,多發(fā)于中老年人，臨床表現(xiàn)多種多樣。經(jīng)典的化療方案緩解率低，而隨著新藥問世、聯(lián)合化療和骨髓造血干細胞移植等新技術(shù)的應(yīng)用，MM患者的緩解率不斷提高。多參數(shù)流式細胞術(shù)免疫表型分析有助于MM診斷，而緩解后患者體內(nèi)MRD分析是判斷療效和預(yù)后的重要指標。目前國內(nèi)有關(guān)MRD的報道多為應(yīng)用于骨髓瘤細胞的膜表面免疫表型。本研究應(yīng)用多參數(shù)流式細胞術(shù)進行胞漿輕鏈的測定，以建立MRD分析方案，并探討其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2010-01至2012-11大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院確診MM患者中經(jīng)化療后完全緩解病例45例，其中女12例，男33例，中位年齡60歲；初診骨髓細胞學(xué)檢查瘤細胞占15%～95%，其中分泌型為37例(IgG型27例，IgA型10例)，輕鏈型為5例(λ鏈型4例，κ鏈型1例)，不分泌型3例，其完全緩解后形態(tài)學(xué)及血清學(xué)均為陰性。

1.2 儀器和試劑 流式細胞儀：FACSCalibur 美國BD公司。CD38-FITC/CD56-PE/CD19-Percp、CD138-PE、CD45-APC、κ-FITC/λ-PE/ CD19- Percp、κ-FITC/λ-PE、IgG2a-FITC、IgG1-PE，溶血素、破膜劑，以上試劑均購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本處理 抽取0．2 ml骨髓液涂片作顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查；另抽取2 ml置于EDTA-K2抗凝血常規(guī)管作MRD檢測，48 h內(nèi)完成檢驗。骨髓涂片行瑞氏-吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并分類計數(shù)200個有核細胞。抗凝的骨髓液l ml，加3 ml PBS液，混勻后，在水平離心機上離心(1500 r/min，5 min)，棄去上清液，加1 ml PBS液，計數(shù)白細胞數(shù)，調(diào)節(jié)至5×106/ml，制成細胞懸液備用。

1.3.2 胞膜標記及胞漿內(nèi)輕鏈標記 (1) 胞膜的標記：每管100 μl細胞懸液分別加入(IgG2a-FITC、IgG1-PE、CD45-APC)、(CD38-FITC /CD56-PE/CD19-Percp、CD45-APC)、(CD138-PE、CD45-APC)、(κ-FITC/λ-PE/ CD19- Percp、CD45-APC)各20 μl，混勻避光15 min，加配置好的溶血素2 ml，避光10 min，在水平離心機上離心(1500 r/min，5 min)，棄去上清液，加1 ml PBS液，混勻備用。(2)胞漿內(nèi)輕鏈標記：取兩只試管，每管100 μl細胞懸液分別加入CD45-APC 20 μl，避光15 min，再加入破膜劑A液100 μl，避光10 min，加溶血素2 ml，避光10 min，在水平離心機上離心(1500 r/min，5 min)，棄去上清液，加入破膜劑B液50 μl，分別加入(IgG2a- FITC、IgG1-PE)、(κ-FITC/λ-PE)，避光15 min，加2 ml PBS洗滌，在水平離心機上離心(1500 r/min，5 min)，棄去上清液，加1 ml PBS液，混勻備用。

1.3.3 流式細胞儀測定 用熒光微球校準儀器及補償后，用Cellquset軟件收取(2～4)×105個細胞，通過CD45/SSC和CD38/CD56聯(lián)合設(shè)門，確定瘤細胞的位置及抗原表達情況。

1.3.4 MRD分析 本實驗組合CD38、CD56、CDl9、CD45、CD138進行四色MRD分析。根據(jù)散點圖，先根據(jù)前角散射光(Fsc)和側(cè)角散射光(Ssc)來設(shè)R1門，排除碎片的干擾，依照R1，再根據(jù)CD38和CD56散點圖，選取CD38+CD56+/_的細胞團設(shè)R2門[1]，再在CD45和Ssc及CD19和Ssc散點圖上，根據(jù)R2的細胞團來選取CD45-CD19-細胞群設(shè)R3門，然后根據(jù)CD138+來確定R3細胞團是否是漿細胞團，最后根據(jù)異常胞漿κ/λ的表達，來確定是否是瘤細胞及其表達率 (圖1，圖2)[2]。根據(jù)此上的免疫分型，本研究設(shè)計了以下兩種瘤細胞的免疫組合：CD19+CD38+CD56+CD45-CD138+和CD19-CD38+CD56-CD45-CD138+，來尋找漿細胞的位置，最后通過胞漿內(nèi)輕鏈的表達率，來確定MRD的陽性率[3]，其目的主要是排除正常漿細胞和其他有核細胞干擾。結(jié)果判斷：目標細胞異常輕鏈表達>0.1%，即為MRD陽性[4]。

圖1 免疫表型為CD38+CD56+CD138+CD19-CD45-

圖2 免疫表型為CD38+CD56-CD138+CD19-CD45-

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.1軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，率的比較應(yīng)用χ2檢驗；MRD兩組間中位生存時間的比較應(yīng)用log-rank檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫表型及胞漿輕鏈表達 表型為CD38+CD56+CD19-CD45-出現(xiàn)的頻率為：分泌型中100% (37/37)，輕鏈型20%(1/5)，不分泌型0%(0/3)；表型為CD38+CD56-CD19-CD45-出現(xiàn)的頻率為：輕鏈型80%(4/5)，不分泌型100%(3/3)，見表1。

2.2 兩種免疫表型的MRD陽性率 CD38+CD56-CD138+CD19-CD45-的MRD的陽性率為100%(7/7)，明顯高于CD38+CD56+CD138+CD19-CD45-陽性率18%(7/38)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 兩種胞漿輕鏈的MRD陽性率 胞漿輕鏈(cκ鏈)MDR的陽性率為25%(3/12)，胞漿輕鏈(cλ鏈)MDR的陽性率為33%(11/33)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 多發(fā)性骨髓瘤45例細胞確診時免疫表型及胞漿輕鏈的表達 (n;%)

2.4 復(fù)發(fā)率與無病生存時間 病例隨訪時間2～24個月。MRD陰性組31例中4例復(fù)發(fā)(13%)，陽性組14例中10例復(fù)發(fā)(71%)，兩組復(fù)發(fā)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MRD陰性組的累積無病生存時間中位數(shù)為15.53(9.35～21.62)個月，明顯長于MRD陽性組的9.75(3.69～14.24)個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

MM傳統(tǒng)意義上CR患者體內(nèi)仍殘留約1010個腫瘤細胞，被認為是疾病進展和復(fù)發(fā)的根源。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測和血、尿蛋白電泳等方法分析MRD有一定的局限性[5]。形態(tài)學(xué)是最普遍、最基礎(chǔ)的檢測手段，在一定程度上可反映治療效果。但骨髓瘤細胞常呈灶狀或斑點狀分布，穿刺部位不同、骨髓稀釋、制片不佳導(dǎo)致骨髓瘤細胞堆積在片尾或邊緣都會降低瘤細胞的比例，且有時形態(tài)學(xué)上不易與正常漿細胞區(qū)分，也難以反映緩解期內(nèi)腫瘤負荷的變化，且靈敏度僅能達到5×10-2水平[6]。血、尿蛋白電泳可間接反映腫瘤負荷量，但特異性較低，敏感度也不高[7]。筆者采用多參數(shù)流式細胞術(shù)研究MM 細胞的免疫表型特征及胞漿輕鏈的表達，并據(jù)此建立監(jiān)測MRD的方法，為MM 的預(yù)后判斷和個體化治療提供可靠依據(jù)[8]。

歐洲骨髓瘤協(xié)作組(European Myeloma Network，EMN)在流式細胞術(shù)免疫分型方面達成共識，推薦MM分型至少要用CD38、 CD138、CD45三種抗體來識別漿細胞，初診設(shè)漿細胞門要基于CD38/CD138的共表達[9]。筆者在此基礎(chǔ)上初診增加CD56、CD19、胞漿輕鏈(κ/λ)的檢測，在所有45例的患者中，骨髓瘤細胞的免疫表型主要為兩種表型CD38+CD56+CD138+CD19-CD45-和CD38+CD56-CD138+CD19-CD45-，并且都異常表達一種胞漿輕鏈，所謂的單克隆表達。根據(jù)以上免疫表型，利用CD45作為設(shè)門抗體，聯(lián)合CD38、CD56、CD138、CD19來確定漿細胞的位置[10]，因為CD45在絕大部分的漿細胞中不表達或者弱表達，而CD138為漿細胞共同抗原，而CD19為B細胞的抗原，通過檢測CD19來排除B細胞膜表面輕鏈及排除一些相關(guān)的B細胞的疾病對此實驗的影響，同時檢測胞漿內(nèi)輕鏈的含量來確定是否是骨髓瘤細胞和其殘余量。而國內(nèi)的相關(guān)文獻報道一般利用三色或四色流式細胞儀通過檢測漿細胞膜表面標志CD138或者CD38來檢測MM的MRD更加準確和客觀，避免把一些正常的漿細胞記入為瘤細胞[11]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)免疫表型為CD38+CD56-CD138+CD19-CD45-的多發(fā)性骨髓瘤患者均為輕鏈型和不分泌型，并且MRD的檢測均為陽性，提示此型的預(yù)后較差，但因收集的標本例數(shù)較少，尚需大樣本數(shù)據(jù)支持。

MRD陽性的患者其復(fù)發(fā)率高于陰性的患者，而生存期短于陰性的患者，這就為臨床監(jiān)測和治療骨髓瘤疾病提供了可靠的依據(jù)。對于處于完全緩解期的骨髓瘤患者，如果發(fā)現(xiàn)MRD陽性，應(yīng)該鞏固和加強治療，以期望MRD轉(zhuǎn)為陰性，來獲得更好的療效[6，12]。

對于骨髓瘤MRD的檢測，初診時應(yīng)全面分析MM患者免疫表型和胞漿輕鏈，并且記錄和保存好，特別是對一些輕鏈型和不分泌型的骨髓瘤患者，因為其血清學(xué)的表現(xiàn)尤為不明顯，檢測胞漿輕鏈顯得尤為重要，這樣才能為以后的MRD檢測提供更可靠的依據(jù)。

盡管高劑量化療聯(lián)合自體造血干細胞移植已經(jīng)可以使多數(shù)MM患者達到完全緩解，但復(fù)發(fā)仍是臨床影響患者生存期的主要問題。多參數(shù)流式細胞術(shù)是目前檢測MRD敏感性和特異性都很高的方法[13，14]。應(yīng)用四色免疫熒光流式細胞術(shù)，通過CD45作為設(shè)門抗體，應(yīng)用CD45-APC/SSC及CD38/CD56/CD19及CD138聯(lián)合設(shè)門，通過檢測胞漿內(nèi)輕鏈(cκ鏈、cλ鏈)含量對多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病變監(jiān)測以及判斷預(yù)后具有重要價值，并對臨床開展相關(guān)治療具有指導(dǎo)意義。

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(2013-08-16收稿 2013-10-30修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Valueofcytoplasmlightchaindetectioninminimalresidualdiseaseofmultiplemyeloma

ZHAO Yingnan1and ZHU Jie2.
Department of Clinical Laboratory, Dalian Hospital, Liaoning Provincial Corps of Chinese People’s Armed Police Forces, Dalian 116017, China; 2. Department of Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, China

ObjectiveTo study the role of light chain detection in the minimal residual disease (MRD) of multiple myeloma (MM).MethodsThe light chains of 45 bone marrow samples from the patients who were diagnosed as having MM and showed complete remission after some treatments were tested using four color flow cytometry (CD45-APC/SSC, CD38/CD56/CD19 and CD138 were detected together). The positive rate of MRD was determined according to the results of flow cytometry and the progression of the disease of each patient was followed up. After that, whether the positive rate of MRD affected recurrence rate and disease free survival (DFS) of MM was analyzed.ResultsAmong the 45 cases, 37 were of secretory type (IgG 27 cases; IgA 10 cases); 5 were of light chain type (λ chain:4 cases; κ chain: 1 case) and 3 were of un-secretory type. As the frequency of immunophenotype, 37/37(100%) secretory type, 1/5(20%)light chain type and 0/3(0%)showed CD38+CD56+CD19-CD45-; 4/5(80%)light chain type and 3/3(100%)un-secretory type showed CD38+CD56-CD19-CD45-; 100% (45/45) cases showed CD138+and light chain in cytoplasm positive. Among secretory type cases, 10/37(27%)was cκ chain and 27/37(73%)was cλ chain. Among light chain type cases, 1/5(20%)was cκ chain and 4/5(80%)was cλ chain. Among un-secretory type cases, 1/3(33%)was cκchain and 2/3(67%)was cλ chain. After treatment, the samples from the complete remission patients were tested again. The positive rate of CD38+CD56+CD138+CD19-CD45-was 7/38(18%),which was significantly lower than that of CD38+CD56-CD138+CD19-CD45-(7/7, 100%),P<0.05. And there was no significant difference in MRD between cκ chain (3/12, 25%) and cλ chain (11/33, 33%),P>0.05. After 24 months’ follow-up, the recurrence rate in negative MRD group was 13%(4/31), which was significantly lower than that in positive MRD group (71%, 10/14),P<0.05. The median of disease-free interval in negative MRD group was 15.53 (9.35-21.62) months, which was significantly longer than that in positive MRD group 9.75 (3.69-14.24) months,P<0.05.ConclusionsThe detection of light chain in cytoplasm may be an important marker for predicting MRD in MM and it also may guide the direction of related clinic treatment.

multiple myeloma； immunephenotype; cytoplasmic light chain; flow cytometry; minimal residual disease

趙英男，本科學(xué)歷，主管技師，E-mail: san.zhao@163.com

1. 116013，武警遼寧總隊醫(yī)院大連分院檢驗科；2. 116027，大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院檢驗科

朱 杰，E-mail:zhujie1111@aliyun.com

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