溫鋼　劉海燕　楊梅

摘要：從某水產(chǎn)市場附近土壤中分離篩選出4株具殼聚糖酶能力的微生物菌株，其中菌株S03具有較高的產(chǎn)酶能力，經(jīng)鑒定屬于毛霉屬（Mmucor sp.）。試驗條件下該菌株培養(yǎng)3 d時，發(fā)酵液中殼聚糖酶活性最高。并進一步證明該菌株所產(chǎn)殼聚糖酶屬于誘導型殼聚糖酶，適量添加葡萄糖有助于殼聚糖酶的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：殼聚糖酶；酶活力；鑒定

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0347-02

收稿日期：2013-05-07

作者簡介：溫鋼（1976—），男，吉林四平人，碩士，講師，研究方向為應用微生物。E-mail：315554062@qq.com。殼聚糖（chitosan）別稱甲殼胺，是甲殼質(zhì)脫去部分乙酰基的產(chǎn)物，是一類由2-氨基-2-脫氧-葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脫氧-葡萄糖（<40%）單體通過β-1，4糖苷鍵連接而成的直鏈多糖[1]。殼聚糖是自然界中唯一的天然陽離子高聚物，其特殊的化學結(jié)構(gòu)決定了這種高聚物有著獨特的生物活性。殼聚糖具有提高人體免疫力、促進傷口愈合、降血脂、降血壓等保健作用，是一種有廣泛應用前景的醫(yī)療保健材料[2]。另外，殼聚糖還有很好的殺菌、抑菌作用。但是由于殼聚糖分子量大，不溶于水，不易被人體吸收，從而限制了這種物質(zhì)作為醫(yī)療保健品的應用。利用殼聚糖降解得到殼低聚糖，不但容易被人體吸收，而且某些殼寡聚糖還有許多新穎的生物活性，在治療癌癥和提高人體免疫力方面有很好的試驗效果[3]。目前降解殼聚糖的方法主要有化學降解法和酶降解法，其中酶降解法以降解過程容易控制、反應條件溫和以及對環(huán)境沒有污染等優(yōu)點成為殼聚糖降解的首選途徑[4]，因此進一步選育殼聚糖酶產(chǎn)生菌株就顯得尤為重要。本研究選育出具有一定產(chǎn)殼聚糖酶能力的菌株，并初步考察了其產(chǎn)酶能力，以期為后續(xù)殼聚糖酶發(fā)酵生產(chǎn)及應用研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

殼聚糖和氨基葡萄糖購于國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

膠體殼聚糖：取5 g殼聚糖加入100 mL 0.4 mol/L HCl溶液中，50 ℃攪拌至殼聚糖完全溶解，加入1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0，得5%膠體殼聚糖。

1.2培養(yǎng)基

膠體殼聚糖液體培養(yǎng)基：A液：1%膠體殼聚糖；B液：04% K2HPO4·3H2O，0.2% KH2PO4，0.14% MgSO4·7H2O，0.1% NaCl，0.1% KCl，0.02% CaCl2，0.1%酵母粉，3%瓊脂，pH值7.2；將A液、B液分別滅菌后等體積混合。

殼聚糖粉末培養(yǎng)基：1%殼聚糖粉末，0.07% K2HPO4·3H2O，0.03% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.03%蛋白胨，0.03%酵母粉，pH值7.2。

1.3方法

1.3.1菌株初篩將采集土樣加入適量蒸餾水搖勻，梯度稀釋后，涂布于膠體殼聚糖固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，逐一挑取平板上生長狀況良好且能夠形成水解圈的菌株，再次接種于膠體殼聚糖固體培養(yǎng)基平板，測定菌落直徑和透明圈直徑，進一步比較菌株利用殼聚糖的能力。將分離所得菌株分別編號，進一步參考相關(guān)文獻[5]進行菌種鑒定。

1.3.2菌株降解能力考察將菌株接種于殼聚糖液體培養(yǎng)基中，接種后于150 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)，定時取樣，12 000 r/min 離心10 min后得粗酶液，采用DNS法測定殼聚糖酶活性[6]。具體方法為：在0.5 mL粗酶液中加入磷酸緩沖液（pH值7.2）1.0 mL和1%膠體殼聚糖0.5 mL，混勻后于46 ℃保溫30 min，沸水浴10 min。4 000 r/min離心5 min后，取2 mL上清液與1 mL DNS試劑混合，沸水浴中反應5 min后冷卻至室溫，加入4 mL去離子水，混勻后于540 nm處測定吸光度，并根據(jù)氨基葡萄糖標準曲線計算殼聚糖酶活性。

酶活性單位的定義：pH值 7.2、溫度46 ℃時，1 mL樣品1 min催化生成1 μmol氨基葡萄糖的還原糖量所需的酶量為1個酶活單位（U/mL）。

1.3.3菌株生長曲線的測定將菌株接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定時取樣，測定菌體干重和發(fā)酵液酶活性，考察菌株生長曲線和酶活性隨時間變化的規(guī)律。

1.3.4其他影響菌株產(chǎn)酶能力因素的考察

1.3.4.1不同碳源對產(chǎn)酶誘導的影響在液體培養(yǎng)基中，分別以1%殼聚糖粉末、1%膠體殼聚糖、1%甲殼質(zhì)、1%可溶性淀粉、1%葡萄糖、1%蔗糖、1%殼聚糖粉末+0.1%葡萄糖、2%殼聚糖粉末+0.1%葡萄糖、5%殼聚糖粉末+0.1%葡萄糖、1%殼聚糖粉末+1%葡萄糖作為碳源，接入菌種后150 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，測定殼聚糖酶活性，考察碳源對菌株產(chǎn)酶能力的影響。

1.3.4.2培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響將菌株接入裝有100 mL殼聚糖粉末液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別在25、28、30、35、37 ℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后，測定發(fā)酵液酶活性，考察培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.3.4.3培養(yǎng)基起始pH值對產(chǎn)酶的影響將菌株接入裝有100 mL殼聚糖粉末液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，將培養(yǎng)基起始pH值分別調(diào)至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后，測定發(fā)酵液酶活性，考察培養(yǎng)基起始pH值對菌株產(chǎn)酶的影響。

2結(jié)果與分析

2.1菌株初篩

經(jīng)富集培養(yǎng)、反復劃線分離與純化，得到4株能在膠體殼聚糖固體培養(yǎng)基上生長并形成水解圈的菌株，分別編號為S01、S02、 S03、S04。挑取純化菌株接種于PHBV膠體殼聚糖固體平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h后測量菌落直徑（d）、水解圈直徑（D），結(jié)果見表1。endprint

2.2菌株S03的分類鑒定

菌株S03的菌落形態(tài)不定型，培養(yǎng)初期菌絲呈白色，后轉(zhuǎn)為灰白色至黑色，菌絲在培養(yǎng)基內(nèi)外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲。菌絲無隔、多核、分枝狀，成熟菌絲體上直接生出單生、總狀分枝或假軸狀分枝的孢囊梗。各分枝頂端著生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。這些性質(zhì)與毛霉屬（Mucor）微生物菌株的基本性質(zhì)一致，依據(jù)Ainsworth分類系統(tǒng)初步鑒定菌株S03屬于毛霉屬。

2.3菌株S03生長曲線及培養(yǎng)時間對其產(chǎn)酶能力的影響

在微生物液體發(fā)酵過程中，為了高度積累目的產(chǎn)物，常須要掌握發(fā)酵代謝和酶活性的最旺盛時期，該時期也是高效積累產(chǎn)物的時期。微生物各生長階段對目的產(chǎn)物都有重要影響，因此必須根據(jù)不同微生物生長特點，把其控制在有利于增加目的產(chǎn)物的最適條件下培養(yǎng)。由圖1可知，從菌株S03的生長曲線和產(chǎn)酶時程來看，在培養(yǎng)1～6 d時菌株穩(wěn)定生長，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)3 d，此時殼聚糖酶活性達到1.37 U/mL。

2.4不同碳源對菌株 S03產(chǎn)殼聚糖酶的影響

不同碳源對菌株 S03產(chǎn)酶的影響見表2。殼聚糖酶包括組成型和誘導型，其中多數(shù)為誘導型。本研究中只有以殼聚糖或與其結(jié)構(gòu)類似物作為碳源時才能誘導產(chǎn)酶，僅以蔗糖或葡萄糖為碳源菌株雖能生長良好卻不能誘導產(chǎn)酶[7]。添加葡萄糖促進了酶活性的增長，說明菌株 S03產(chǎn)生的殼聚糖酶也屬于誘導型殼聚糖酶；但葡萄糖添加過多，并不利于殼聚糖酶的產(chǎn)生。試驗還發(fā)現(xiàn)，菌株S03在以甲殼質(zhì)和殼聚糖為誘導物的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶能力差別較大，表明該菌株為較專一的產(chǎn)殼聚糖酶菌株。

表2不同碳源對菌株S03產(chǎn)酶能力的影響

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末殼聚糖10.961%膠體殼聚糖11.391%甲殼質(zhì)10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末殼聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5溫度、pH值等發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

由圖2可見，培養(yǎng)溫度為28～30 ℃時，菌株S03產(chǎn)殼聚糖酶能力較高。

由圖3可見，培養(yǎng)基起始pH值對產(chǎn)酶的影響比較明顯，當pH值為5.5～6.5時菌株S03產(chǎn)酶能力較高，pH值為6.0時該菌產(chǎn)酶能力最強，酶活性最高。

3結(jié)論

本研究通過平板劃線分離法篩選到4株產(chǎn)酶能力較強的菌株，在以殼聚糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生明顯的水解透明圈，其中菌株 S03產(chǎn)酶能力較強，系統(tǒng)分離鑒定表明

其屬于毛霉屬。在試驗條件下菌株 S03產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)3 d時，在以粉末殼聚糖作為碳源的培養(yǎng)基中適量添加葡萄糖可以促進菌體增殖從而更利于產(chǎn)酶，說明該菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶屬于誘導酶。本研究為進一步開發(fā)利用微生物殼聚糖酶資源奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]戴蕓，朱旭芬. 微生物殼聚糖酶的研究概況[J]. 浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2004，30（2）：229-236.

[2]陳小娥，夏文水，余曉斌. 微生物殼聚糖酶研究進展[J]. 海洋科學，2004，28（3）：72-76.

[3]Tanaka T，F(xiàn)ujiwara S，Nishikori S，et al. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5338-5344.

[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

[5]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1979：58-91.

[6]張龍翔，張庭芳，李令媛. 生化試驗方法和技術(shù)[M]. 2版.北京：高等教育出版社，1997：1-2.

[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.張紅，沈永龍，黃金田，等. 幾種池塘養(yǎng)殖模式對水體葉綠素a含量周年變化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（1）：349-350.endprint

2.2菌株S03的分類鑒定

菌株S03的菌落形態(tài)不定型，培養(yǎng)初期菌絲呈白色，后轉(zhuǎn)為灰白色至黑色，菌絲在培養(yǎng)基內(nèi)外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲。菌絲無隔、多核、分枝狀，成熟菌絲體上直接生出單生、總狀分枝或假軸狀分枝的孢囊梗。各分枝頂端著生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。這些性質(zhì)與毛霉屬（Mucor）微生物菌株的基本性質(zhì)一致，依據(jù)Ainsworth分類系統(tǒng)初步鑒定菌株S03屬于毛霉屬。

2.3菌株S03生長曲線及培養(yǎng)時間對其產(chǎn)酶能力的影響

在微生物液體發(fā)酵過程中，為了高度積累目的產(chǎn)物，常須要掌握發(fā)酵代謝和酶活性的最旺盛時期，該時期也是高效積累產(chǎn)物的時期。微生物各生長階段對目的產(chǎn)物都有重要影響，因此必須根據(jù)不同微生物生長特點，把其控制在有利于增加目的產(chǎn)物的最適條件下培養(yǎng)。由圖1可知，從菌株S03的生長曲線和產(chǎn)酶時程來看，在培養(yǎng)1～6 d時菌株穩(wěn)定生長，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)3 d，此時殼聚糖酶活性達到1.37 U/mL。

2.4不同碳源對菌株 S03產(chǎn)殼聚糖酶的影響

不同碳源對菌株 S03產(chǎn)酶的影響見表2。殼聚糖酶包括組成型和誘導型，其中多數(shù)為誘導型。本研究中只有以殼聚糖或與其結(jié)構(gòu)類似物作為碳源時才能誘導產(chǎn)酶，僅以蔗糖或葡萄糖為碳源菌株雖能生長良好卻不能誘導產(chǎn)酶[7]。添加葡萄糖促進了酶活性的增長，說明菌株 S03產(chǎn)生的殼聚糖酶也屬于誘導型殼聚糖酶；但葡萄糖添加過多，并不利于殼聚糖酶的產(chǎn)生。試驗還發(fā)現(xiàn)，菌株S03在以甲殼質(zhì)和殼聚糖為誘導物的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶能力差別較大，表明該菌株為較專一的產(chǎn)殼聚糖酶菌株。

表2不同碳源對菌株S03產(chǎn)酶能力的影響

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末殼聚糖10.961%膠體殼聚糖11.391%甲殼質(zhì)10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末殼聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5溫度、pH值等發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

由圖2可見，培養(yǎng)溫度為28～30 ℃時，菌株S03產(chǎn)殼聚糖酶能力較高。

由圖3可見，培養(yǎng)基起始pH值對產(chǎn)酶的影響比較明顯，當pH值為5.5～6.5時菌株S03產(chǎn)酶能力較高，pH值為6.0時該菌產(chǎn)酶能力最強，酶活性最高。

3結(jié)論

本研究通過平板劃線分離法篩選到4株產(chǎn)酶能力較強的菌株，在以殼聚糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生明顯的水解透明圈，其中菌株 S03產(chǎn)酶能力較強，系統(tǒng)分離鑒定表明

其屬于毛霉屬。在試驗條件下菌株 S03產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)3 d時，在以粉末殼聚糖作為碳源的培養(yǎng)基中適量添加葡萄糖可以促進菌體增殖從而更利于產(chǎn)酶，說明該菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶屬于誘導酶。本研究為進一步開發(fā)利用微生物殼聚糖酶資源奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]戴蕓，朱旭芬. 微生物殼聚糖酶的研究概況[J]. 浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2004，30（2）：229-236.

[2]陳小娥，夏文水，余曉斌. 微生物殼聚糖酶研究進展[J]. 海洋科學，2004，28（3）：72-76.

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[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

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[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.張紅，沈永龍，黃金田，等. 幾種池塘養(yǎng)殖模式對水體葉綠素a含量周年變化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（1）：349-350.endprint

2.2菌株S03的分類鑒定

菌株S03的菌落形態(tài)不定型，培養(yǎng)初期菌絲呈白色，后轉(zhuǎn)為灰白色至黑色，菌絲在培養(yǎng)基內(nèi)外能廣泛蔓延，無假根或匍匐菌絲。菌絲無隔、多核、分枝狀，成熟菌絲體上直接生出單生、總狀分枝或假軸狀分枝的孢囊梗。各分枝頂端著生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。這些性質(zhì)與毛霉屬（Mucor）微生物菌株的基本性質(zhì)一致，依據(jù)Ainsworth分類系統(tǒng)初步鑒定菌株S03屬于毛霉屬。

2.3菌株S03生長曲線及培養(yǎng)時間對其產(chǎn)酶能力的影響

在微生物液體發(fā)酵過程中，為了高度積累目的產(chǎn)物，常須要掌握發(fā)酵代謝和酶活性的最旺盛時期，該時期也是高效積累產(chǎn)物的時期。微生物各生長階段對目的產(chǎn)物都有重要影響，因此必須根據(jù)不同微生物生長特點，把其控制在有利于增加目的產(chǎn)物的最適條件下培養(yǎng)。由圖1可知，從菌株S03的生長曲線和產(chǎn)酶時程來看，在培養(yǎng)1～6 d時菌株穩(wěn)定生長，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)3 d，此時殼聚糖酶活性達到1.37 U/mL。

2.4不同碳源對菌株 S03產(chǎn)殼聚糖酶的影響

不同碳源對菌株 S03產(chǎn)酶的影響見表2。殼聚糖酶包括組成型和誘導型，其中多數(shù)為誘導型。本研究中只有以殼聚糖或與其結(jié)構(gòu)類似物作為碳源時才能誘導產(chǎn)酶，僅以蔗糖或葡萄糖為碳源菌株雖能生長良好卻不能誘導產(chǎn)酶[7]。添加葡萄糖促進了酶活性的增長，說明菌株 S03產(chǎn)生的殼聚糖酶也屬于誘導型殼聚糖酶；但葡萄糖添加過多，并不利于殼聚糖酶的產(chǎn)生。試驗還發(fā)現(xiàn)，菌株S03在以甲殼質(zhì)和殼聚糖為誘導物的培養(yǎng)基中產(chǎn)酶能力差別較大，表明該菌株為較專一的產(chǎn)殼聚糖酶菌株。

表2不同碳源對菌株S03產(chǎn)酶能力的影響

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末殼聚糖10.961%膠體殼聚糖11.391%甲殼質(zhì)10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末殼聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末殼聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5溫度、pH值等發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

由圖2可見，培養(yǎng)溫度為28～30 ℃時，菌株S03產(chǎn)殼聚糖酶能力較高。

由圖3可見，培養(yǎng)基起始pH值對產(chǎn)酶的影響比較明顯，當pH值為5.5～6.5時菌株S03產(chǎn)酶能力較高，pH值為6.0時該菌產(chǎn)酶能力最強，酶活性最高。

3結(jié)論

本研究通過平板劃線分離法篩選到4株產(chǎn)酶能力較強的菌株，在以殼聚糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生明顯的水解透明圈，其中菌株 S03產(chǎn)酶能力較強，系統(tǒng)分離鑒定表明

其屬于毛霉屬。在試驗條件下菌株 S03產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)3 d時，在以粉末殼聚糖作為碳源的培養(yǎng)基中適量添加葡萄糖可以促進菌體增殖從而更利于產(chǎn)酶，說明該菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶屬于誘導酶。本研究為進一步開發(fā)利用微生物殼聚糖酶資源奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]戴蕓，朱旭芬. 微生物殼聚糖酶的研究概況[J]. 浙江大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2004，30（2）：229-236.

[2]陳小娥，夏文水，余曉斌. 微生物殼聚糖酶研究進展[J]. 海洋科學，2004，28（3）：72-76.

[3]Tanaka T，F(xiàn)ujiwara S，Nishikori S，et al. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5338-5344.

[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

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[6]張龍翔，張庭芳，李令媛. 生化試驗方法和技術(shù)[M]. 2版.北京：高等教育出版社，1997：1-2.

[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.張紅，沈永龍，黃金田，等. 幾種池塘養(yǎng)殖模式對水體葉綠素a含量周年變化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（1）：349-350.endprint