蘇長(zhǎng)躍等

摘 要：本文綜述了分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用于瓜類(lèi)蔬菜種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助選擇、品種純度鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及基因定位等方面的研究進(jìn)展，對(duì)目前分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于瓜類(lèi)蔬菜育種中存在的問(wèn)題進(jìn)行了探討，并對(duì)其應(yīng)用前景做了展望，以期為今后瓜類(lèi)蔬菜高效分子育種技術(shù)的建立提供參考。

關(guān)鍵詞：瓜類(lèi)蔬菜；分子標(biāo)記技術(shù)；輔助育種；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)：S642.036 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）04-0136-04

瓜類(lèi)蔬菜在我國(guó)蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位。分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映[1]。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，使植物育種的“間接選擇”成為可能，大大提高了遺傳分析的準(zhǔn)確性和選育品種的有效性[2]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在蔬菜育種中的作用越來(lái)越受到重視[3]。本文綜述了幾種常見(jiàn)的分子標(biāo)記技術(shù)在瓜類(lèi)蔬菜育種中的研究進(jìn)展，以期為瓜類(lèi)蔬菜高效分子育種體系的建立提供參考。

1 分子標(biāo)記技術(shù)種類(lèi)

Bostein等（1980）最早利用限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性 （Restriction fragment length polymorphism， RFLP）作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，開(kāi)創(chuàng)了直接利用DNA多態(tài)性發(fā)展遺傳標(biāo)記的新階段[4]。DNA分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、易于自動(dòng)化[9]，與傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記相比具有許多特殊優(yōu)點(diǎn)，如不受環(huán)境、季節(jié)限制，不受個(gè)體發(fā)育階段影響，不存在基因表達(dá)與否的問(wèn)題等[5～8]?，F(xiàn)已發(fā)展出十幾種DNA標(biāo)記技術(shù)，概括起來(lái)主要包括以下3種類(lèi)型：

①基于雜交的分子標(biāo)記技術(shù)，如 RFLP。

②基于PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)，它又分為兩類(lèi)。一是僅基于PCR的擴(kuò)增方法。它包括使用隨機(jī)引物（Arbitrary primer） 進(jìn)行擴(kuò)增的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（Random amplified polymorphic DNA， RAPD），和采用特定引物或引物對(duì)擴(kuò)增的標(biāo)記技術(shù)，主要有序列特異性擴(kuò)增區(qū) （Sequence characterized amplified region， SCAR）、微衛(wèi)星DNA （ Microsatellite DNA），又稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列 （Simple sequence repeat， SSR）和ISSR（Inter simple sequence repeat）等。其中SCAR屬于位點(diǎn)特異的PCR標(biāo)記方法，其他則屬于多位點(diǎn)標(biāo)記方法，檢測(cè)區(qū)域均與微衛(wèi)星序列有關(guān)。二是PCR與酶切相結(jié)合的方法。主要指擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism， AFLP）和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence， CAPS）兩類(lèi)。其中AFLP 是先酶切，再用特殊設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增；而CAPS是先擴(kuò)增，再酶切擴(kuò)增片段，檢測(cè)酶切片段的長(zhǎng)度多態(tài)性。

③基于DNA序列和芯片的分子標(biāo)記技術(shù)，如單核苷酸多態(tài)性 （Single nucleotide polymorphism， SNP）。

每種DNA 分子標(biāo)記技術(shù)都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用性，需要研究者結(jié)合實(shí)際加以選擇。

2 分子標(biāo)記技術(shù)在瓜類(lèi)蔬菜育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)主要涉及分子遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性研究、品種純度鑒定、親緣關(guān)系鑒定、重要基因的標(biāo)記與定位、分子標(biāo)記輔助選擇、基因的圖位克隆等許多領(lǐng)域，其在瓜類(lèi)蔬菜育種中的應(yīng)用，提高了瓜類(lèi)蔬菜作物的育種效率[10]。

2.1 種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究

隨著生物學(xué)尤其是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，植物遺傳多樣性的檢測(cè)水平獲得了顯著提高，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)（染色體）、生理生化水平逐步發(fā)展到分子水平，為物種起源、品種分類(lèi)的研究提供了理論依據(jù)。分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)的是基因組水平上的差異，非常穩(wěn)定，不受外界環(huán)境影響，并且通過(guò)對(duì)遺傳圖譜的分析，可以準(zhǔn)確區(qū)分品種間的差異，為種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性的分析提供可靠、有效的工具[11～13]。

趙娜等[14]采用61對(duì)SSR特異引物對(duì)46份厚皮甜瓜進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示，供試材料的遺傳相似系數(shù)達(dá)到了0.62，說(shuō)明這46份厚皮甜瓜材料的親緣關(guān)系非常近。盛云燕等[15]在甜瓜SSR標(biāo)記遺傳多樣性研究中，采用50對(duì)SSR特異引物對(duì)46份甜瓜栽培品種（系）進(jìn)行分析，有48對(duì)引物擴(kuò)增出譜帶，其中46對(duì)具有多樣性，結(jié)果顯示，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)可以提高甜瓜栽培品種多樣性分析的準(zhǔn)確性。尚建立等[16]以我國(guó)西瓜、甜瓜種質(zhì)資源中期庫(kù)內(nèi)1 200份西瓜種質(zhì)為材料，對(duì)果實(shí)重量、果肉顏色、中心糖、種子千粒重等12項(xiàng)主要植物學(xué)性狀進(jìn)行遺傳多樣性和相關(guān)性分析。高山等[17]采用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)38份苦瓜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，兩種標(biāo)記技術(shù)都能擴(kuò)增出各自的多態(tài)性譜帶，反應(yīng)了苦瓜種質(zhì)豐富的遺傳多樣性；其中RAPD標(biāo)記將供試苦瓜種質(zhì)劃分為3個(gè)類(lèi)群6組，與張長(zhǎng)遠(yuǎn)等[18]對(duì)苦瓜親緣關(guān)系的RAPD分析結(jié)論基本一致。楊衍等[19]對(duì)36份苦瓜種質(zhì)資源利用AFLP技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系評(píng)價(jià)分析，將供試材料分為2個(gè)類(lèi)群。Gaikwad等[20]也做過(guò)類(lèi)似的相關(guān)研究。李曉慧等[21]利用SRAP分子標(biāo)記對(duì)西瓜品種的多態(tài)性進(jìn)行分析，探討了西瓜的遺傳多樣性。段會(huì)軍等[22]對(duì)50個(gè)西瓜枯萎病菌株的RAPD、ISSR和AFLP分子標(biāo)記的研究揭示了西瓜枯萎病菌株分子水平上的遺傳多樣性，同時(shí)也說(shuō)明了西瓜枯萎病遺傳分化較大，存在著比較豐富的遺傳變異，為西瓜抗病育種和西瓜枯萎病的綜合防治提供理論依據(jù)。Paris等[23]利用AFLP、ISSR、SSR標(biāo)記對(duì)45個(gè)南瓜品種進(jìn)行研究，將其分為3個(gè)亞種。黃秀麗[24]利用種子蛋白質(zhì)與幾種同工酶電泳及RAPD標(biāo)記對(duì)南瓜屬4個(gè)栽培種間的親緣關(guān)系進(jìn)行探討，結(jié)果表明中國(guó)南瓜與美洲南瓜親緣關(guān)系最近，與印度南瓜關(guān)系較遠(yuǎn)。endprint

2.2 分子標(biāo)記輔助選擇

傳統(tǒng)的育種主要依賴(lài)于植株的表現(xiàn)型進(jìn)行選擇，環(huán)境條件、基因間的互作、基因型與環(huán)境互作等多種因素都會(huì)影響表現(xiàn)型選擇效率，一個(gè)優(yōu)良品種的培育往往需花費(fèi)7～8年甚至十幾年時(shí)間。如何提高選擇效率，是育種工作的關(guān)鍵。分子標(biāo)記輔助選擇育種可以對(duì)作物在早期進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的選擇，減少育種過(guò)程的盲目性和周期性，提高育種效率，加速育種進(jìn)程[25，26]。

王懷松等[27]以抗病的7-2和感病的7-1、7-3雜交組合與分離群體為試材進(jìn)行了甜瓜抗白粉病連鎖分子標(biāo)記研究，建立了甜瓜抗白粉病AFLP標(biāo)記技術(shù)體系，找到了一個(gè)與甜瓜白粉病抗病基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記：M60/E25-520。馬鴻艷[28]利用獲得的2對(duì)SSR標(biāo)記結(jié)合田間接種鑒定對(duì)101份甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行抗白粉病篩選，結(jié)果顯示，引物SSR04816平均符合率為81.4%，引物SSR01498平均符合率為68.6%，引物SSR04816鑒定結(jié)果符合率大于80%，可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。張曉波等[29]對(duì)甜瓜雌雄異花同株和雄全同株材料間雜交后代及回交后代的花性型分離進(jìn)行研究，在F2代中利用SSR技術(shù)對(duì)單性花基因進(jìn)行了分子標(biāo)記篩選并找到了與該基因連鎖的標(biāo)記，遺傳距離分別為7.0 cM和29.5 cM。孫曉丹等[30]利用形態(tài)學(xué)觀察、經(jīng)典遺傳性狀分析、AFLP分子標(biāo)記等技術(shù)在形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記水平上研究了黃瓜嫩果白色果皮顏色遺傳規(guī)律，開(kāi)發(fā)出實(shí)用有效的分子標(biāo)記，提高了黃瓜育種工作效率。為了加速培育出人們青睞的優(yōu)質(zhì)黃皮西瓜，王日升等[31]以西瓜黑皮母本（H97）和黃皮父本（2605）構(gòu)建的BC1分離群體為材料，利用RAPD技術(shù)篩選出一個(gè)與黃皮性狀基因連鎖的RAPD標(biāo)記AI09-1500，重組率為17.2%。

2.3 品種純度鑒定

種子質(zhì)量的高低影響農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)，在種子質(zhì)量檢驗(yàn)的各個(gè)指標(biāo)中，品種純度檢驗(yàn)尤為重要。傳統(tǒng)的品種純度鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力且受環(huán)境、人為等多方面影響。分子標(biāo)記技術(shù)以種子的DNA作為檢測(cè)對(duì)象，在植物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)，且不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在是否表達(dá)的問(wèn)題[32]。

羊杏平等[33]利用RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)鑒定西瓜雜交種抗病蘇蜜和蘇蜜5號(hào)的遺傳純度，成功發(fā)現(xiàn)了能用于純度檢測(cè)的7個(gè)RAPD母本特異引物、4個(gè)RAPD父本特異引物、2個(gè)ISSR母本特異引物及2個(gè)RAPD父母本特異標(biāo)記共顯性引物，對(duì)于西瓜雜交種的遺傳純度檢測(cè)具有重要意義。李菊芬等[34]應(yīng)用RAPD、ISSR和SSR三種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西瓜雜交種“東方紅1號(hào)”和“8424”純度的快速鑒定進(jìn)行了研究，在73對(duì)SSR引物中，各篩選到3對(duì)多態(tài)性引物能夠用于雜交種純度鑒定，且SSR鑒定結(jié)果與大田形態(tài)鑒定結(jié)果一致。李菊芬等[35]研究還顯示，應(yīng)用篩選出的SSR引物組合，能夠有效地檢測(cè)出混雜在雜交種中的母本自交系種子，也能檢測(cè)出其它不明來(lái)源花粉所導(dǎo)致的生物性混雜，提高了甜瓜雜交種純度檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

2.4 遺傳圖譜構(gòu)建及基因定位

分子遺傳圖譜是指以遺傳標(biāo)記為基礎(chǔ)的染色體或基因位點(diǎn)的相對(duì)位置的線(xiàn)性排列圖[36]。遺傳圖譜的構(gòu)建是瓜類(lèi)蔬菜分子研究的重要內(nèi)容之一，是基因定位與圖位克隆及基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)，為分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

路緒強(qiáng)等[37]利用甜瓜全雌系W1998（無(wú)雄花）與雌雄異花同株品系3-2-2（有雄花）雜交，F(xiàn)1代全部為雌雄異花同株，以F2代為試材，采用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建甜瓜遺傳圖譜，并定位了甜瓜控制雄花分化基因（An），進(jìn)一步完善了甜瓜性別分化的表達(dá)機(jī)制。王軍輝等[38]利用抗黃瓜花葉病毒（CMV）的黃瓜材料F-3和感CMV的黃瓜材料HZL04-1為親本，構(gòu)建了包含190個(gè)F2代的遺傳作物群體，采用SSR、EST-SSR、SCAR三種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳連鎖分析，構(gòu)建了黃瓜遺傳連鎖圖譜，該圖譜為黃瓜抗CMV的QTL定位奠定了基礎(chǔ)。易克等[39]以野生西瓜種質(zhì)PI296341為父本，普通西瓜97103為母本，獲得F8的重組自交系群體，通過(guò)16個(gè)SSR引物和5個(gè)ISSR引物組成的48個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了一個(gè)包括11個(gè)連鎖群的分子圖譜，總長(zhǎng)度為558.1 cM，平均圖距為11.9 cM。Yeboah等[40]利用SRAP和ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)黃瓜F2代群體進(jìn)行標(biāo)記分析，共獲得109個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，構(gòu)建了包含7個(gè)連鎖群的連鎖圖譜，基因位點(diǎn)平均間距為16 cM。盡管分子標(biāo)記在瓜類(lèi)作物的遺傳圖譜和基因定位方面取得了很大進(jìn)展，但是飽和度高且能滿(mǎn)足育種需求的遺傳圖譜尚未見(jiàn)報(bào)道。

3 問(wèn)題與展望

近幾年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展、完善，但是利用分子標(biāo)記大規(guī)模培育瓜類(lèi)蔬菜作物優(yōu)良品系或品種的愿望仍未實(shí)現(xiàn)。多數(shù)研究仍處在起步階段，缺乏合理有效的試驗(yàn)依據(jù)；瓜類(lèi)作物的遺傳圖譜飽和度較低，無(wú)法滿(mǎn)足育種的需求[41]；與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒別方法相比，DNA分子標(biāo)記技術(shù)所需儀器精密、藥品昂貴、程序復(fù)雜，難以普及和應(yīng)用[26]。因此，今后應(yīng)充分利用不同分子標(biāo)記技術(shù)加快遺傳圖譜的整合工作，提高其飽和度，完善高密度遺傳標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建，同時(shí)開(kāi)展新型分子標(biāo)記的研究，尋求經(jīng)濟(jì)實(shí)用的新性狀標(biāo)記，并與常規(guī)育種有效結(jié)合起來(lái)，為瓜類(lèi)蔬菜育種提供更好的服務(wù)。

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