顧寅鈺等

摘 要：

黃酮是具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）是哌啶類多羥基生物堿，二者均為桑葉的主要有效成分，因其資源豐富、功效顯著，近年來備受關(guān)注。本文綜述了影響桑葉中黃酮與1-DNJ含量的因素及其檢測方法。

關(guān)鍵詞：桑葉；黃酮；1-DNJ；含量；檢測方法

中圖分類號：S888.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）04-0140-06

桑葉，為桑科植物桑（ Morus alba L.） 的葉。味苦、甘，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏風散熱、清肺潤燥、清肝明目的功能，是一種常用中藥[1]。桑葉的主要有效成分有黃酮類、生物堿、植物甾醇、γ-氨基丁酸、桑葉多糖等，其中研究最多的是黃酮和1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）。本文綜述了桑葉中黃酮和1-DNJ含量的影響因素及其檢測方法。

1 黃酮類化合物

黃酮類化合物（flavonoids）是一類存在于自然界的具有2-苯基色原酮（flavone）結(jié)構(gòu)的化合物。它們分子中有一個酮式羰基，第一位上的氧原子具有堿性，能與強酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類，小部分以游離態(tài)（苷元）的形式存在。絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，它在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要作用。

桑葉黃酮類成分主要包括蘆丁、槲皮素、異槲皮素和二氫山萘等，占桑葉干重的1%～3%。桑是植物界莖葉黃酮含量較高的一類植物。Kim[2]從桑葉中分離到9種黃酮類成分；Kayo[3]從桑葉的丁醇提取物中也分離到9種黃酮類化合物，其中蕓香苷的含量最高；張雁冰等[4]從馬桑葉的乙醇提取物中分離到山奈酚、槲皮素等9種黃酮類化合物；楊燕等[5]從長穗桑的乙醇提取物中分離到3種黃酮類化合物；劉利等[6]從桑葉中提取、分離、鑒定了3種黃酮類化合物。

1.1 含量影響因素

桑葉中黃酮的含量與桑品種、產(chǎn)地、季節(jié)以及葉位等都有顯著相關(guān)性。

1.1.1 品種 劉利等[7]研究表明，長穗桑、華桑葉片總黃酮含量分別為63.92、61.17 mg/g，極顯著高于其它桑種，白桑則極顯著低于其它桑種。郭小補等[8]的試驗結(jié)果表明，總黃酮含量最高的品種是粵誘33，質(zhì)量分數(shù)為3.92%，最低的是云桑一號，僅為0.76%。劉春蓮等[9]研究發(fā)現(xiàn)，桐鄉(xiāng)青的黃酮平均含量最高， 新一之瀨次之， 湖桑32最低。

張軍等[13]報道顯示，湖桑9001的蘆丁含量是湖桑32的2倍，是白桑、雞桑、廣東桑的4倍；而槲皮素的含量則是湖桑32最高，雞桑最低。吳好好等[16]發(fā)現(xiàn)，湖桑197、農(nóng)桑14號、盛東1號的綠原酸較高，果桑大10的蘆丁含量較高，湖桑197、盛東1號的異槲皮苷較高，果桑大10的蘆丁含量大于異槲皮苷，而其他品種則是異槲皮苷高于蘆丁。馬合木提·買買提明等[27]研究表明，新疆藥桑葉蘆丁和異槲皮苷的含量較高，槲皮素的含量較低，蘆丁和異槲皮苷的含量是槲皮素含量的3倍。

1.1.2 產(chǎn)地 張如松等[10]檢測了9個產(chǎn)地的桑葉，其中以臨安產(chǎn)的桑葉中黃酮類成分含量最高， 嘉興的最低。穆春旭等[11]的試驗結(jié)果顯示，各產(chǎn)地的桑葉黃酮含量由高到低依次為山東、遼寧、河南、浙江、重慶。孟磊等[12]的結(jié)果表明，新疆吐魯番地區(qū)的桑葉黃酮含量最高，其次是和田的黑桑，阿克蘇地區(qū)的含量最低。

1.1.3 季節(jié) 多數(shù)人認為冬季桑葉的黃酮含量較高，這也是中藥采用霜桑葉的原因之一。孫敏耀等[15]發(fā)現(xiàn)，9月份采收的桑葉黃酮含量最高，7月份最低。徐健飛等[14]的結(jié)果表明，桑樹生長前期黃酮含量較低，桑樹停止生長后到晚秋后的這段時間較高。張軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)地桑葉中的蘆丁和槲皮素以6月份采摘的含量較低，10月份達到最高。吳好好等[16]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸在冬季桑葉中明顯高于春夏秋，而蘆丁和異槲皮素則是冬季高于春季或與之持平并大大超過夏秋季。

1.1.4 葉位 楊普香等[17]的結(jié)果表明，桑葉黃酮類化合物含量隨葉位的降低或葉質(zhì)的變老而逐步減少，桑芽中的含量介于1～3位葉與4～6位葉之間。劉春蓮等[9]發(fā)現(xiàn)，桑樹嫩頭的黃酮類化合物含量較高，下部葉片較少。

另外，黃酮種類不同，其隨品種、產(chǎn)地、季節(jié)與葉位變化的規(guī)律也不同。

1.2 含量檢測方法

1.2.1 分光光度法 分光光度法是目前應用較普遍的一種方法，操作簡便，結(jié)果可靠，重復性好。紫外-可見分光光度法是在檢測桑葉黃酮時應用最多的方法，標準品一般采用蘆丁，波長多采用510 nm，樣品提取主要有水提法和醇提法兩種，甲醇與乙醇的提取效率相近[19]。超聲提取明顯優(yōu)于索氏提取與水煮提取[18]，以70%乙醇超聲提取45 min效果最好[20]，但70%乙醇超聲提取 60 min的含量最高[11]。

熒光分光光度法操作簡便、快速、準確，靈敏度高。一般以蘆丁為標準品，乙醇作溶劑，緩沖液為醋酸-醋酸鈉。王艷[21]報道，其激發(fā)和發(fā)射波長分別為436 nm和483 nm；而阿布都許庫爾·吐爾遜等 [22]則認為，激發(fā)波長297 nm、發(fā)射波長432 nm較佳。

1.2.2 高效液相色譜法（HPLC） 近年來，高效液相色譜法（HPLC）逐漸被運用到桑葉黃酮及其苷類化合物的檢測中。該方法易于操作，有很高的準確度、精密度和很好的重復性、穩(wěn)定性。目前研究中多采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），色譜柱多選擇C18柱，檢測波長為360 nm左右。艾國民等[23]以乙腈-水為流動相，槲皮素為標準品；劉麗芳等[24]以蘆丁、槲皮素為標準品，采用甲醇-0.5%磷酸溶液梯度洗脫；吳好好等[16]以綠原酸、蘆丁、異槲皮苷為標準品，用90%乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫；吳秋生等[25]以蘆丁、槲皮素為標準品，流動相分別采用四氫呋喃-磷酸和乙腈-醋酸緩沖液。endprint

1.2.3 高效毛細管電泳法（HPCE） 該技術(shù)是一種高效分離分析技術(shù)，具有靈敏度高、柱效高、分析速度快、所需樣品量少、溶劑消耗少和抗污染能力強等優(yōu)點。檢測波長多為245 nm，緩沖液可采用磷酸二氫鈉-硼砂溶液[26]、Na2B4O7溶液[27]、含有15%甲醇的磷酸二氫鈉-硼砂溶液等[28]。

在以上方法中，分光光度法因其操作簡單且儀器較為普及而倍受歡迎。

2 1-DNJ

1-脫氧野尻霉素（ 1-deoxynojirimycin，1-DNJ） 是存在于桑樹等植物和微生物中的一種多羥基哌啶生物堿，也是桑葉生物堿中研究最多的一種，是一種極性含N化合物，化學名稱是3， 4， 5-三羥基-2-羥甲基四氫哌啶，分子式為C6H13NO4，相對分子質(zhì)量為163.17。1-DNJ 具有與α-1， 4-葡萄糖類似的結(jié)構(gòu)，是α-葡糖苷酶抑制劑，具有降血糖功能，此外還具有抗腫瘤及抗病毒活性，因此引起國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注。

1976年Yagi等[29]首次從市售桑白皮即桑根皮中分離到天然DNJ， 并定名為“moranoline” （mp 204～205℃，C6H13NO4），同時從新鮮的桑根、葉、皮等部位也能分離到，結(jié)構(gòu)為（2R， 3R， 4R， 5S） -2-hydroxymethyl-3， 4， 5-trihydroxypiperidine）。日本學者Asano等[30]從桑葉中分離出多種多羥基生物堿，包括1-DNJ。至今科學家們已陸續(xù)從桑樹的各生長部位分離發(fā)現(xiàn)了一系列DNJ及其衍生物。

2.1 含量影響因素

桑葉中的1-DNJ含量是隨著桑品種、產(chǎn)地、季節(jié)、葉位以及環(huán)境條件不同而變化的。由于1-DNJ是桑葉的主要有效成分之一，因此，近年來有很多學者致力于1-DNJ含量影響因素的研究。

2.1.1 品種 李有貴等[31]測定了云南省不同地區(qū)的 59 份野生桑葉，其中來自開遠地區(qū)的巖桑1-DNJ含量高達 0.7911%。劉凡等[32] 檢測了98 份桑樹品種資源，結(jié)果表明4 個桑種間以及多倍體和二倍體桑樹品種間沒有顯著差異，但不同品種間差異明顯，其中白桑種的育 7803含量最高，為1.54 mg/g，另外廣東桑種的黑皮桑、抗銹 2 和白桑種的阿2桑葉中1-DNJ 含量也較高。李化秀等[33]選取山東省內(nèi)有代表性的17個桑品種進行1-DNJ檢測，桑屬不同種間與不同桑品種間均存在顯著性差異，其中白桑最高，晉選6號和秋雨分別是魯桑和白桑中含量最高的品種，分別為0.227%和0.3281%。

2.1.2 產(chǎn)地 孟夏等[34]試驗表明，不同產(chǎn)地1-DNJ含量差異較大， 其中海南的瓊41和陜西的豬桑含量最高， 分別為0.344%和0.309%；而江蘇的湖桑32號和新疆的疏勒白桑含量較少。魯戰(zhàn)會等[35]研究了全國9個蠶桑主產(chǎn)省區(qū)不同產(chǎn)地樣品25份， 結(jié)果最高的為陜西漢中， 其次為江西宜春、 廣西合浦和山東濰坊，未發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)地的關(guān)聯(lián)性。

2.1.3 季節(jié) 楊兵[36]和歐陽臻[37]等都認為4 月份1-DNJ含量較低，5 月份開始增高，到 7、8 月份含量最高，9、10 月份又降低，11 月份霜后的含量也變低，推測桑葉中 1-DNJ 含量可能與溫度有關(guān)。關(guān)麗萍等[38]卻認為在秋季采集的桑葉中1-DNJ含量較高。葉晶晶等[39]則認為，嫩芽和嫩葉中的含量以晚秋最高， 成熟葉中以夏季最高， 而老葉中的含量以春季最高。此外， 不同發(fā)育階段桑葉中含量的變化幅度以春季最小， 晚秋變化最大。

2.1.4 葉位 同一季節(jié)不同發(fā)育時期的1-DNJ含量均隨葉位由高到低遞減，嫩芽>嫩葉>成熟葉>老葉[39]。魏兆軍等[40]的結(jié)果也表明，第 1 葉位至第 5 葉位1-DNJ的含量逐漸降低。

2.1.5 環(huán)境條件 遮蔭處理能顯著增加桑苗葉片的1-DNJ 含量，在25%光強下處理5 d 時，桑苗葉片中1-DNJ 含量最高，達0.2043%；遮蔭5 d 后繼續(xù)遮蔭對桑葉中1-DNJ 含量基本沒有影響[41]。氮磷鉀肥的施肥水平及其配比均能顯著影響桑葉中1-DNJ質(zhì)量分數(shù)，桑葉中總1-DNJ最佳經(jīng)濟產(chǎn)量為23.23 kg/hm2，推薦施肥指標氮為286.1 kg/hm2，五氧化二磷為95.2 kg/hm2，氧化鉀為159.6 kg/hm2。

與黃酮不同的是，1-DNJ在溫度較高季節(jié)、生長較為旺盛時期含量較高，若是側(cè)重桑葉在降血糖上的應用應該考慮季節(jié)的因素。

2.2 檢測方法

1-DNJ及其衍生物結(jié)構(gòu)中含有較多羥基，屬氮雜糖類，結(jié)構(gòu)中沒有苯環(huán)、雙鍵、羰基等發(fā)色團，在可見光區(qū)和紫外光區(qū)都沒有吸收，因此定性定量分析都較困難。

2.2.1 高效液相色譜法（HPLC） 高效液相色譜法是目前1-DNJ檢測中使用較多的方法。一種是不需要進行衍生化，可以借助特殊檢測器直接檢測1-DNJ，如蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、示差折光檢測器、質(zhì)譜等。ELSD最大的優(yōu)越性在于能檢測不含發(fā)色團的化合物，并在沒有標準品或者化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測未知化合物，簡便、快捷，重現(xiàn)性好， 靈敏度高。姜永濤[43]、宋婕[44]、陳正收[45]等均采用此法對1-DNJ進行了檢測，色譜柱均采用NH2柱，流動相均為乙腈-水，ELSD漂移管溫度為50℃左右。示差折光檢測器是一種高度穩(wěn)定和靈敏的色譜檢測器，可用于檢測在紫外光范圍內(nèi)吸光度弱的化合物。歐陽華學等[47]采用的色譜柱為Zorbax Carbohydrate，流動相為乙腈-水，該方法簡便、快速。高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）選擇性強、靈敏度高。戴開金等[46]以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相， SHIMADZU HRC-NH2柱分離， 質(zhì)譜條件為：采用大氣壓化學電離源（APCI）， 164.1/146.1、164.1/110.2兩對離子， 多反應監(jiān)測（MRM）。endprint

另一種是1-DNJ需要進行柱前衍生化反應，然后利用紫外-可見檢測器、熒光檢測器以及二極管陣列檢測器等進行檢測。熒光檢測器具有靈敏度極高、結(jié)果更準確、可靠等優(yōu)點，歐陽臻等[50]用芴甲氧酰氯（FMOC-Cl）與 1-DNJ 反應生成熒光產(chǎn)物，色譜柱為C18分析柱及 ODS3 預柱，流動相為乙腈-0.1% 醋酸，熒光檢測器激發(fā)波長254 nm，發(fā)射波長322 nm。謝慧明等[51]采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）進行衍生化，激發(fā)波長為250 nm、發(fā)射波長為395 nm。紫外檢測法雖不及熒光檢測法的靈敏度高，但是由于檢測器相對便宜，一般的高效液相色譜儀均有配備，因此更易于推廣普及。施新琴等[48]用9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC）為衍化劑，在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液中進行衍生化反應，色譜柱為C18柱，檢測波長為254 nm，流動相為乙腈-0.1%醋酸水溶液。張旻[49]則采用2， 4-二硝基氟苯（DNFB）進行衍生化反應，流動相為乙腈-0.1%醋酸甲醇，檢測波長355 nm。二極管陣列檢測器，也稱PDA（photo-diode array）、PDAD（photo-diode array detector）或DAD（diode array detector）。陳正收等[45]采用C18為色譜柱，乙腈-0. 1%醋酸溶液為流動相，檢測波長為265 nm 。

上述檢測器中蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、示差折光檢測器、質(zhì)譜以及熒光檢測器與紫外檢測器相比，適用范圍相對狹窄、價格相對昂貴，一般高效液相色譜儀上較少配置，故在應用普及方面不及紫外檢測器范圍廣。

2.2.2 氣相色譜法 該法先將1-DNJ乙?；煞悬c較低的酯類，再采用氣相色譜法檢測。該方法操作簡便， 能夠快速、準確檢測出桑葉中的1-DNJ含量。汪孟夏[52]采用色譜柱OV-1701，檢測器溫度310℃，氫氣流量47 mL/min。李宏等[53]則采用色譜柱DB-5，檢測器溫度260℃，氫氣流量60.0 mL/min。

2.2.3 分光光度法 分光光度法被廣泛應用于不同物質(zhì)的含量測定，1-DNJ本身無紫外-可見光吸收，但與顯色劑碘-碘化鉀混合后，其吸收光譜發(fā)生了變化，在334 nm處，一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度與1-DNJ濃度符合Lambert-Beer定律，據(jù)此可用分光光度法測定桑葉中1-DNJ含量。楊海霞[54]、黎歡吉[55]等用陽離子交換層析法純化桑葉中的1-DNJ，并采用紫外-可見分光光度計對桑葉中1-DNJ含量進行了測定。胡瑞君等[56]利用微波輔助提取技術(shù)提取桑葉中的1-DNJ，采用分光光度法測定 1-DNJ 含量。但由于1-DNJ本身沒有顏色，其它少量色素的存在就可能對溶液的吸光度產(chǎn)生影響，所以較少采用分光光度計檢測。

在以上的檢測方法中，采用較多的是柱前衍生化后經(jīng)高效液相色譜檢測，檢測器以常用的紫外和熒光檢測器較多。

3 結(jié)語

黃酮與1-DNJ是目前桑中研究較多的成分，而能否提供一種快速、準確的測定方法是深入研究的首要條件，因此眾多學者致力于各種檢測方法的研究，以簡便與準確為目標開發(fā)新的或改進原有的檢測方法依然是今后的研究方向之一。關(guān)于產(chǎn)地對二者的影響方面，由于沒有不同產(chǎn)地種植的同一桑品種黃酮與1-DNJ含量變化規(guī)律的報道，所以現(xiàn)有的關(guān)于產(chǎn)地的差異性結(jié)果，可能直接或間接地受到了品種、溫度以及施肥情況的影響，具有一定的局限性，需要進一步研究。另外，進一步探明黃酮與施肥情況以及光照等環(huán)境因素的關(guān)系，以及影響桑葉中黃酮、1-DNJ等諸多活性成分含量的主導和非主導因素，都是今后的研究方向，這都將為以后進一步利用桑資源的藥用價值提供理論依據(jù)，同時促進蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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