基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的雞新城疫病毒sFLISA檢測技術(shù)研究

房保海　孫濤　賈俊濤　岳志芹　姜英輝　趙玉然　梁成珠　徐彪

摘要：本研究建立了基于量子點(diǎn)的雞新城疫病毒（NDV） sFLISA檢測方法。該方法以抗NDV多克隆抗體為捕捉抗體、以生物素標(biāo)記抗NDV單克隆抗體為檢測抗體、以量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為熒光探針。該方法與其它有關(guān)禽類病毒（產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒）無交叉反應(yīng)，比血凝試驗(yàn)靈敏，為臨床早期快速檢測NDV提供了行之有效的方法。

關(guān)鍵詞：雞新城疫病毒（NDV）；量子點(diǎn)；雙抗夾心熒光免疫分析（sFLISA）

中圖分類號：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0118-04

新城疫是由新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）引起的急性、高度接觸性傳染病，常呈敗血癥，主要特征是呼吸困難、下痢、神經(jīng)機(jī)能紊亂、黏膜和漿膜出血，嚴(yán)重危及禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)流行于世界各國[1～3]。新城疫被國際獸疫局（OIE）定為A類傳染病，中國將其列為一類動物疫病[4]。

新城疫病毒的檢測主要應(yīng)用免疫方法（包括免疫傳感技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)、免疫組化技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等）和分子生物學(xué)技術(shù)（包括RT-PCR技術(shù)、基因芯片、液相芯片技術(shù)等）[5]。量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）是近年發(fā)展起來的一種新型熒光納米材料，與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，具有熒光穩(wěn)定性高、吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄而對稱、衰減壽命長、生物相容性好等特點(diǎn)，已經(jīng)成為病原檢測的新工具[6～9]。

本研究以抗NDV多克隆抗體為捕捉抗體，以生物素標(biāo)記抗NDV單克隆抗體為檢測抗體，以量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為熒光探針，建立了NDV sFLISA檢測方法，為養(yǎng)殖業(yè)早期發(fā)現(xiàn)NDV感染提供了有力的工具。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

滅活新城疫病毒（NDV，HA效價為256）和陽性尿囊液病毒由本試驗(yàn)室保存。雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品、抗雞新城疫病毒陽性血清和雞新城疫試驗(yàn)用陰性血清購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2主要試劑和抗體

兔抗NDV多克隆抗體（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；鼠抗NDV單克隆抗體（GLOBAL BIOTECH，1 μg/μL）；量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素-605（QS605，武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限公司）；包被液：0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）；洗滌液：0.5% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBS）；封閉液：1× BSA-PBS。

1.3主要儀器和器材

多功能熒光酶標(biāo)儀（SpectraMax M5）；6930型冷凍離心機(jī)（日本KUBOTA公司）；5415R 微量冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；MS3渦流旋轉(zhuǎn)振蕩儀（德國IKA公司）；黑色底透的熒光酶標(biāo)板（Thermofisher NUNC）；Eppendorf移液槍（0～200 μL、0～1000 μL，德國Eppendorf 公司）；冰箱[冷藏溫度（4±1）℃，中國海爾]；恒溫培養(yǎng)箱[（37±1）℃、（42±1）℃，日本SANYO]。

1.4尿囊液病毒的制備

4℃反復(fù)凍融尿囊液3次，然后3 000、5 000、8 000 r/min 各離心30 min，上清經(jīng)100 000×g離心2 h，用少量 TEN 緩沖液將病毒沉淀懸浮，再用20%～60%的蔗糖溶液經(jīng)密度梯度離心純化，經(jīng)100 000×g 離心8 h，收集40%～60%梯度層內(nèi)的病毒帶，用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 透析48 h，分裝，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 sFLISA標(biāo)準(zhǔn)操作程序

sFLISA在NUNC酶標(biāo)板反應(yīng)微孔中完成，具體實(shí)驗(yàn)方法如圖1所示。微孔板先用100 μL含有1.25 μg/mL的抗NDV多克隆抗體在4 ℃包被過夜（包被液：0.05 mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液）；洗滌液洗滌3次，200 μL/孔，每次3 min；用1×BSA-PBS封閉，300 μL/孔，37℃ 封閉2 h；洗滌液洗板3次后，加入待測樣品，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入1∶200稀釋的生物素標(biāo)記NDV單克隆抗體，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板后加入量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素?zé)晒馓结槪?7℃孵育1 h，洗板后晾干。陰性對照孔加陰性血清，空白對照孔加入100 μL PBS，通過熒光分光光度計(jì)測定其相對熒光強(qiáng)度。

1.6sFLISA工作條件的優(yōu)化

1.6.1多抗包被濃度、生物素標(biāo)記單克隆抗體稀釋度的確定抗NDV多克隆抗體以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL等5個稀釋濃度各100 μL豎排包被聚苯乙烯板，4℃過夜；洗滌封閉后加入標(biāo)準(zhǔn)抗原NDV，100 μL/孔，固定標(biāo)準(zhǔn)抗原NDV濃度；洗滌拍干，生物素標(biāo)記抗NDV單克隆抗體以1∶200、1∶400、1∶800共3個稀釋濃度各100 μL反應(yīng)，37℃作用1 h；洗滌拍干，加入1∶100稀釋的量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃作用1 h，洗滌拍干后在多功能酶標(biāo)儀上用390 nm的激發(fā)波長、605 nm的發(fā)射波長讀取相對熒光強(qiáng)度（RFU）值。根據(jù)P/N比值，以確定包被抗體和生物素標(biāo)記抗體的最佳濃度。

1.6.2量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)的優(yōu)化以NDV包被酶標(biāo)板，生物素標(biāo)記抗體按1∶200稀釋作為檢測抗體，量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素分別按照1∶50、1∶100、1∶200稀釋，100 μL/孔加入，37 ℃作用1 h，洗滌拍干后在多功能酶標(biāo)儀上用390 nm的激發(fā)波長、605 nm的發(fā)射波長讀取相對熒光強(qiáng)度（RFU）值。根據(jù)P/N比值，以確定量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)。endprint

1.7陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

采用建立的sFLISA方法進(jìn)行12次陰性對照檢測，計(jì)算相對熒光單位RFU的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），陽性臨界值=陰性樣品的X+3SD。檢測時，當(dāng)樣品RFU>陽性臨界值，判斷為陽性。

1.8sFLISA敏感度檢測

確定單抗和多抗的最佳工作濃度，將純化的尿囊液病毒在1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280等8個稀釋度進(jìn)行測定，同時進(jìn)行原倍毒液試驗(yàn)，設(shè)陰性和空白對照。

1.9sFLISA特異性試驗(yàn)

用建立的檢測方法對NDV、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品進(jìn)行檢測，確定所建立檢測方法的特異性。

1.10重復(fù)性試驗(yàn)

在同一個酶標(biāo)板內(nèi)檢測NDV、NDV國家標(biāo)準(zhǔn)品和尿囊液制備的NDV，每樣重復(fù)3次；選取3塊不同酶標(biāo)板，每個板重復(fù)3孔，按1.5的步驟進(jìn)行sFLISA，分別計(jì)算樣品的板內(nèi)和板間變異系數(shù)（CV）。

1.11阻斷試驗(yàn)

將陽性NDV用滅菌生理鹽水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋后，50 μL分別加入等量的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（1∶10稀釋），37℃作用1 h，10 000 r/min離心，取上清進(jìn)行檢測，以NDV為陽性對照。

2結(jié)果與分析

2.1包被多克隆抗體與生物素標(biāo)記抗體稀釋度的確定

包被抗體分別以10、5、2.5、1.25 μg/mL和0.625 μg/mL進(jìn)行包被，生物素標(biāo)記抗體分別進(jìn)行1∶200、1∶400、1∶800的稀釋，量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素以1∶100的稀釋度進(jìn)行偶聯(lián)。結(jié)果表明，包被抗體單抗為1.25 μg/mL，生物素標(biāo)記的檢測抗體1∶200時，其P/N值最大，為56.028。因此，選擇1.25 μg/mL作為包被抗體的濃度，1∶200 作為生物素標(biāo)記抗體的最佳稀釋度（見表1）。

2.2量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)優(yōu)化

以上述優(yōu)化的條件，即包被抗體濃度為1.25 μg/mL，生物素標(biāo)記的檢測抗體稀釋倍數(shù)為1∶200，對量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果（表2）表明，在1∶100時，P/N值為61.453，最大，故選擇此稀釋倍數(shù)為最優(yōu)稀釋倍數(shù)。

2.3 sFLISA陰陽性界限的確定

在上述優(yōu)化的反應(yīng)參數(shù)條件下，進(jìn)行12次陰性血清sFLISA試驗(yàn)，得到陰性試驗(yàn)平均值為0.361，標(biāo)準(zhǔn)差為0.037，X+3SD =0.472，從而確定RFU 值在0.472及以上為陽性，RFU值在0.361～0.471之間為疑似，RFU值在0.361以下為陰性（表3）。

2.4 敏感性分析

將制備好的尿囊液NDV以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280等8個稀釋度稀釋，按照優(yōu)化sFLSA的條件檢測結(jié)果表明，隨著病毒含量的降低，其RFU 值呈下降趨勢，但當(dāng)病毒1∶640 稀釋時，結(jié)果仍為陽性（RFU值為0.725），表明該方法靈敏度較好。

2.5 特異性試驗(yàn)

在已優(yōu)化的sFLISA反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，對雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原、雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品進(jìn)行了檢測，結(jié)果只有雞新城疫病毒（La Sota株）國家參考品為陽性，其它病毒均為陰性，表明本方法具有較好的特異性（表5）。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

在同一酶標(biāo)板內(nèi)，對NDV、NDV國家標(biāo)準(zhǔn)品和尿囊液制備的病毒進(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，每份樣品重復(fù)3次。重復(fù)性分析結(jié)果顯示：板內(nèi)變異系數(shù)為1.5%～4.1%，板間變異系數(shù)為1.5%～3.0%（表6），變異程度很小，均小于10%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.7阻斷試驗(yàn)

結(jié)果表明（表7），經(jīng)稀釋的NDV作為被檢材料，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能特異性地阻斷NDV與包被抗體的結(jié)合，病毒1∶40稀釋后檢測結(jié)果呈陰性。

量子點(diǎn)作為一種新型的熒光探針，被越來越多地應(yīng)用到病原生物檢測中[8]，但應(yīng)用于動物病毒檢測的研究較少。本研究應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素作為熒光探針、生物素標(biāo)記單克隆抗體作為檢測抗體，通過生物素-親和素之間的特異性互作，建立了一種基于量子點(diǎn)熒光探針的NDV sFLISA檢測方法。通過對已知陽性樣品的比較測定，陽性樣品稀釋至640倍還能檢出；與其它有關(guān)禽類病毒無交叉反應(yīng)（產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒抗原），說明此檢測方法對NDV特異性較強(qiáng)，靈敏度高。該方法的建立為NDV的監(jiān)測和診斷提供了新方法，在進(jìn)出口檢疫上也將發(fā)揮良好的作用。

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