任小龑

摘 要：保藏菌種的目的不僅要保存菌株的生命本身，而且還必須要盡可能地使菌株的遺傳性狀保持不變，同時保證其在整個保存過程中不被雜菌污染。因此，選擇有效且穩(wěn)定的保藏微生物菌種的方法至關(guān)重要。

關(guān)鍵詞：菌種；保存；管理

醫(yī)學病原生物學實驗室主要承擔微生物實驗教學任務(wù)，日常工作中經(jīng)常要分離、鑒定細菌、試教演示、保存菌種等。菌種是微生物實驗的基本材料，因涉及到師生的安全，所以要正確保存，妥善管理，逐步實現(xiàn)菌種的保存制度化與科學化。

一、材料與方法

1.教學實驗常用的菌種保存

營養(yǎng)要求不高的菌種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、志賀氏菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌。

營養(yǎng)要求高的菌種：鏈球菌、肺炎鏈球菌、白喉棒狀桿菌、腦膜炎奈瑟菌。

厭氧芽孢桿菌：產(chǎn)氣莢膜桿菌。

需氧芽胞桿菌：枯草芽孢桿菌。

真菌：白色念珠菌、新生隱球菌。

2.菌種的鑒定

實驗室中保存的菌種都要經(jīng)過鑒定合格后方可使用，常用的鑒定方法有形態(tài)學觀察、菌落特征、生化反應(yīng)及血清學鑒定。

3.菌種的保存

（1）定期傳代保存法

傳代培養(yǎng)就是要定期地進行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是最基本的微生物保存法。傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低，培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。①液體培養(yǎng)基低溫保存法。將保持營養(yǎng)要求不高的細菌接種于裝有營養(yǎng)肉湯的試管中，營養(yǎng)要求高的細菌接種于含15%血清的營養(yǎng)肉湯中，經(jīng)37℃培養(yǎng)18~14小時后，取出封口，置4℃冰箱保存。②半固體穿刺保存法。將細菌穿刺接種于普通半固體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18~24小時后，在無菌條件下加入滅菌液體石蠟，厚度約1厘米，封口后置4℃冰箱保存。③瓊脂斜面保存法。營養(yǎng)要求不高的菌種用普通瓊脂斜面保存法，營養(yǎng)要求高的菌種用血液瓊脂斜面保存，將細菌蜿蜒接種于血液瓊脂斜面上，置37℃培養(yǎng)18~24h后，石臘封口，放于4℃冰箱保存。④沙保氏培養(yǎng)基保存法。該培養(yǎng)基用于保存真菌，將白色念珠菌、新型隱球菌接種于沙保氏半固體培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃培養(yǎng)1~3天后，加入滅菌的液體石蠟，置4℃冰箱保存。

傳代培養(yǎng)保存法操作簡單、使用方便，不需要特殊設(shè)備，是實驗室菌種保存最常用的方法。但其缺點也很明顯，如：保存時間短，菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；反復傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大；雜菌的污染機會較多。

（2）液體石蠟覆蓋保存法

該法較前一種方法保存菌種的時間更長，將液體石蠟滅菌，放于37℃恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。再將已分純的待存菌在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體，用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長好的斜面培養(yǎng)基上，要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右，若不夠此高度，則常會引起斜面抽干現(xiàn)象，將試管直立，貼上標簽，置4℃下保存，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止干燥，并通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。

（3）冷凍真空干燥保存法

將待存菌分純后，用準備好的保護劑牛奶洗下菌苔，把菌懸液滴入菌種管后，在管口抽取少許棉花塞入管內(nèi)細頸處，放入冰箱－40℃速凍40分鐘，放入準備好的混有鹽的冰中，接上真空泵，真空抽干呈粉末狀，火焰封口，貼上標簽，保存于冰箱。此法保存時間長，可達15年，不易變性，但需要專用儀器，一般實驗室難以配備，而且過程復雜，操作難度大，需要較長時間才能完成。所以此方法適合具有條件的實驗室菌種的長期保存。

4.菌種的保管——安全管理制度

（1）專人負責

存放菌種的冰箱加鎖，保管人員定期培訓，具備較強的責任心，嚴格執(zhí)行《病原微生物實驗室生物安全管理條例》。

（2）詳細記錄

每一種菌種都貼標簽，包括名稱、編號、來源、接種日期、鑒定者、保存要求及使用情況。

（3）定期傳代接種

按規(guī)定檢查、鑒定，并接種保證菌種純度質(zhì)量。

二、結(jié)果

液體培養(yǎng)基低溫可保存菌種1年至數(shù)年；半固體穿刺可保存3個月，瓊脂斜面可保存一個月；呂氏血清斜面可保存半個月至一個月；沙包氏培養(yǎng)基可保存3~6個月；冷凍真空干燥可保存3~5年。鏈球菌在普通培養(yǎng)基生長不良，可接種于血液瓊脂斜面上，每隔半個月要重新接種培養(yǎng)；沙包氏培養(yǎng)基保存真菌效果好、時間長。實驗室里保存的菌種不少對人體具有致病性，多次傳代接種易被污染和發(fā)生變異，因此工作人員操作時要規(guī)范并做好安全防護工作，用過的接種環(huán)要立即滅菌，涂片鏡檢后立即消毒，用過的器皿應(yīng)放入指定容器，經(jīng)高壓滅菌處理。

三、討論

保存菌種的原則是根據(jù)微生物的生理、生化特性，盡量降低微生物的代謝水平，使其基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制，但又不至于死亡，以降低菌種的變易率。我們在做實驗過程中或者短期保存菌種時，可以選擇斜面低溫保存法、半固體瓊脂法、液體石蠟保存法、半固體瓊脂石蠟保存法進行保存；如果需要較長時間的保存菌株，可以選擇冷凍真空干燥法保存菌株，此法需要實驗室配備好相應(yīng)的儀器設(shè)備。如果一些菌株營養(yǎng)要求比較高的話，當然上述菌株保存的方法不是最理想、最方便的保存法，還需要我們不斷探索，找到一種或幾種簡單、方便、時間長的最佳保存方法。

參考文獻：

[1]魏保生.醫(yī)學微生物學筆記[M].北京：科學出版社,2009.

[2]唐珊煕.微生物學及微生物學檢驗[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003.