辣椒CaMAPK7 的全長cDNA 克隆及其表達(dá)分析

石蘭平，楊 晟，申 磊，蔡金森，唐 倩，官德義，劉志欽，何水林

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院;3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州350002)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是普遍存在于真核生物的信號傳遞蛋白，一般由多基因家族所編碼，與MAPK 激酶激酶(MAP kinase kinase kinase，MKKK)和MAPK 激酶(MAP kinase kinase，MKK)組成MAPK 三級信號結(jié)聯(lián)參與生物信號傳遞。在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MAPK 信號結(jié)聯(lián)參與了植物激素、生物脅迫及非生物脅迫等過程的信號傳導(dǎo)［1-4］。全基因組分析表明擬南芥、水稻、棉花和辣椒基因組中均含有20 個(gè)左右的MAPK［5-8］，目前僅對其中部分成員開展了結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能分析。水稻中的OsMAPK5a 會(huì)在干旱、高鹽以及低溫下被激活，且在時(shí)空表達(dá)上存在差異［9］。棉花GhMPK2 受到真菌的誘導(dǎo)而表達(dá)并且在抗真菌中起著重要作用［10］;GhMAPK7 不僅在抗病中起作用，還可以促進(jìn)種子的萌發(fā)［11］。大豆GMK1 在高鹽作用下可以從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并且在抗鹽中起到關(guān)鍵作用［12］。迄今關(guān)于MAPK 家族成員的研究還僅限于少數(shù)物種中的少數(shù)成員，對大多數(shù)MAPK 家族成員的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能的認(rèn)識還相當(dāng)有限。

在我國辣椒作為一種重要的蔬菜和工業(yè)原料作物，擁有廣大的播種面積，且產(chǎn)值居首位［13］，但具有較多的土傳病害且是不耐連作的典型的茄科植物。在生產(chǎn)上，多種逆境尤其是病害的發(fā)生容易導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量降低和品質(zhì)劣化，因此，探索辣椒抗逆分子機(jī)制是其抗病抗逆遺傳改良的重要基礎(chǔ)研究工作。本研究以辣椒均一化cDNA 文庫為模板，通過特異性引物PCR 擴(kuò)增出CaMAPK7 的全長cDNA，熒光定量PCR 結(jié)果表明，CaMAPK7 在辣椒根、莖、葉中具有不同程度的組成型表達(dá)，而且其轉(zhuǎn)錄還受到病原菌、高溫和幾種外源激素的誘導(dǎo)表達(dá)，表明該基因可能在辣椒應(yīng)答病原菌侵染和高溫脅迫的信號交互作用中起重要的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒品種120#，由福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供并保存。辣椒均一化文庫為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，Prime ScriptTMRT-PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)和RNA 提取所用的Trizol 均購自大連寶生物TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 CaMAPK7 基因的克隆以及序列分析 首先從辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中提取獲得辣椒MAPK 家族中的所有成員(20 個(gè))，找出其中的CaMAPK7，根據(jù)其5＇和3＇非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，再利用PCR 進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得其全長cDNA。

1.2.2 植物材料的處理 將辣椒種子在水中催芽后均勻播撒于盛有濕潤培養(yǎng)基質(zhì)的托盤中，置于25 ℃溫室內(nèi)培養(yǎng)，待其萌發(fā)至幼苗后，將其轉(zhuǎn)移到小花盆中培養(yǎng)。辣椒長到6 葉期，選取長勢良好，無病害，生長情況相對一致的辣椒苗進(jìn)行激素、病原菌接種以及高溫處理。(1)用100 μmol·L-1乙烯利(ET)、100 μmol·L-1水楊酸(SA)、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)、脫落酸(ABA)分別對辣椒小苗進(jìn)行處理。每小時(shí)用噴霧器對葉片均勻噴施激素一次，同時(shí)另以水作為對照。分別在處理后0、3、6、12、24、48 h 時(shí)進(jìn)行采樣，置于液氮速凍保存后放置于-80 ℃冰箱中，用于RNA 的提取。(2)以用42 ℃作為高溫處理，以25℃處理作為常溫對照。在處理后0、2、6、12、24 h 采樣并低溫保存用于提取RNA。(3)青枯菌接種處理。將本實(shí)驗(yàn)室保存的青枯菌活化后于SPA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600nm=0.8 時(shí)，用10 mmol·L-1MgC12重懸至D600nm=0.8，用無菌注射器注射辣椒葉片。在處理后0、3、6、12、24、48 h 時(shí)采樣并保存，用于提取RNA。同時(shí)，采集該時(shí)期辣椒幼苗的根、莖、葉放置于-80℃冰箱中。用于提取RNA。

1.2.3 總RNA 的提取及RT-PCR 和qPCR 分析 采用Trizol 法提取辣椒葉片及其根、莖和葉等組織的總RNA，以TaKaRa 公司的RT-PCR Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成單鏈的cDNA 作為模板，用于RT-PCR 和qPCR 分析。設(shè)計(jì)1 對特異性RT-PCR 擴(kuò)增引物F:5-TTGATAACCCAAGGGCTAAGGG-3 和R:5-AAGAGGAAACTGAGCGGGAAGA-3。PCR 體系為25 μL:10 ×Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 2 μL，Ex 酶0.2 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃4 min;94 ℃1 min;60 ℃45 s;72 ℃1 min:35 個(gè)循環(huán):72 ℃10 min。qPCR 分析采用實(shí)驗(yàn)室建立和采用體系進(jìn)行。反應(yīng)體系為10 μL:2 ×SYBR 5 μL，引物各0.2 μL，模板1 μL，ddH20 3.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃5 s;94 ℃30 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)，重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaMAPK7 序列分析

從辣椒基因組中找到CaMAPK7(與擬南芥CaMAPK7 同源性最高)，根據(jù)其翻譯起始密碼子和終止子附近高度特異性序列設(shè)計(jì)引物，以辣椒均一化cDNA 文庫為模板，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CR 產(chǎn)物含有1 個(gè)長度為1113 bp 開放閱讀框，編碼長度為370 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，推導(dǎo)的分子量為42.7 ku，p I 為8.29。在功能結(jié)構(gòu)域分析網(wǎng)站SMART 分析表明，該蛋白質(zhì)氨基酸序列含有1 個(gè)長度為207 aa 的STK_c 保守結(jié)構(gòu)域。通過在NCBI 上進(jìn)行蛋白比對BLASTP，找到了該蛋白質(zhì)與很多植物的MAPK 蛋白激酶具有很高的同源性，同源性在84% -97%之間(圖1 -2)。值得指出的是，從辣椒120#上分離獲得的CaMAPK7 堿基序列與網(wǎng)上公布的CM334 中的CaMAPK7 堿基序列完全一致。

圖1 CaMAPK7 與其他植物MAPK 基因的同源比對Fig.1 Alignment analysis of CaMAPK7 with MAPKs from other plant species

圖2 CaMAPK7 與其他植物MAPKs 進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of CaMAPK7 with MAPKs from other plant species

2.2 CaMAPK7 在辣椒不同組織中的表達(dá)分析

分別提取健康辣椒植株根、莖、葉的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，通過熒光定量PCR 檢測了CaMAPK7 在這些組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，CaMAPK7 在各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，在根的表達(dá)最高，其次是莖，葉片中的表達(dá)最低(圖3)。

圖3 CaMAPK7 在辣椒植株不同器官中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Fig.3 Transcriptional expression of CaMAPK7 in different organs in pepper plant

2.3 CaMAPK7 在青枯菌侵染、高溫以及外源激素處理下的表達(dá)分析

2.3.1 青枯菌侵染 青枯病侵染下，12 h 后Ca-MAPK7 開始出現(xiàn)上調(diào)趨勢，24 和48 h 出現(xiàn)了持續(xù)上調(diào)的趨勢(圖4A)。

2.3.2 高溫處理 高溫下，CaMAPK7 在2 h 開始出現(xiàn)上調(diào)趨勢，12 h 上調(diào)達(dá)到了最高水平(圖4B)。

2.3.3 外源激素處理 在MeJA 處理下，CaMAPK7在6 h 開始出現(xiàn)上調(diào)的趨勢，而后12 -48 h 表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)(圖5A);在SA 處理下，6 -48 h 都出現(xiàn)了上調(diào)的趨勢，且12 h 達(dá)到了最高值(圖5B);在ABA 處理下，CaMAPK7 的表達(dá)則出現(xiàn)了連續(xù)下調(diào)的趨勢(圖5C);在ET 處理下，CaMAPK7 在3 h 開始上調(diào)并且達(dá)到了最高值，而后6 -48 h 上調(diào)程度逐漸降低(圖5D)。

圖4 CaMAPK7 在辣椒中應(yīng)答青枯病接種和高溫脅迫處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Fig.4 Transcriptional expression of CaMPAK7 in response to R.solanacearum inoculation and heat stress treatment in pepper plants

圖5 CaMAPK7 在辣椒中應(yīng)答幾種外源激素處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)Fig.5 Transcriptional expression of CaMAPK7 in response to exogenous hormones

3 討論

MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是植物體重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，不僅在植物抗逆過程中起著重要的作用，而且也參與了植物的生長發(fā)育［14-17］。然而，人們對大多數(shù)植物MAPK 家族成員的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能及其機(jī)制的認(rèn)識還相當(dāng)有限。

本研究以辣椒120#的均一化cDNA 為模板，利用CaMAPK7 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得其全長cDNA。根據(jù)測序結(jié)果，其序列與已公布的CM334 基因組中的CaMAPK7 序列一致，表明該基因在不同的辣椒品種中有較強(qiáng)的保守性。

在不同逆境下基因的表達(dá)模式一般與功能之間具有一致性。大量研究表明，植物抗病或抗逆反應(yīng)具有誘導(dǎo)性特點(diǎn)，即受病原菌或逆境誘導(dǎo)表達(dá)［18-19］，這可能是植物歷經(jīng)進(jìn)化過程中嚴(yán)酷的自然選擇形成的生存策略。本研究表明，CaMAPK7 在辣椒不同組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在根部的表達(dá)最強(qiáng)，說明CaMAPK7 可能參與了辣椒正常生理狀態(tài)下的生長發(fā)育，但是，青枯菌侵染和高溫處理，均可不同程度地誘導(dǎo)CaMAPK7 表達(dá)，表明CaMAPK7 除了可能參與植物生長發(fā)育調(diào)控外，可能還與辣椒應(yīng)答病原菌和高溫等逆境密切相關(guān)。鑒于CaMAPK7 的表達(dá)還可受外源SA、MeJA、ABA 和ET 處理的調(diào)控，表明CaMAPK7 介導(dǎo)的辣椒抗病或耐高溫防御反應(yīng)與這些激素介導(dǎo)的信號通路密切相關(guān)。大量研究表明，植物應(yīng)答生物和非生物逆境脅迫的信號通路之間存在著廣泛的交互作用(crosstalk)，Ca2+信使、活性氧、激素介導(dǎo)的信號通路、MAPK 結(jié)聯(lián)、轉(zhuǎn)錄因子等參與了這些交互作用［20-24］，我們推測CaMAPK7 在辣椒應(yīng)答高溫和病原菌侵染的交互作用中也起著重要作用，有必要進(jìn)一步開展研究予以證實(shí)。

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