馮永明,邢應(yīng)香*,劉洪青,章 勇

(1.安徽省地質(zhì)實驗研究所，安徽 合肥 230001；2.賽默飛世爾科技(上海)有限公司，上海 201206)

硒是人體必需的15種微量元素之一，體內(nèi)良好的含硒狀態(tài)能減少腫瘤的發(fā)生率[1-3]，因此硒是預(yù)防腫瘤的營養(yǎng)元素[4]。隨著生物體內(nèi)微量元素硒的含量對生物影響的研究越來越深入，對準(zhǔn)確測定生物樣品中微量元素硒的方法研究日益緊迫，對其測定準(zhǔn)確性和檢出限的要求也越來越高。

生物樣品含有大量的有機(jī)物質(zhì)，在測定工作中首先要完全破壞有機(jī)物，其中的硒含量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于土壤、巖石等地質(zhì)樣品。傳統(tǒng)的樣品前處理方法主要是針對土壤、巖石等地質(zhì)樣品，明顯不能適用于生物樣品。硒是類金屬元素，由于在樣品消解過程中硒易生成揮發(fā)性化合物，在樣品消解方法的選擇上需考慮硒元素的這個特性，避免樣品中硒的揮發(fā)損失。目前生物樣品的前處理方法通常采用硝酸緩慢低溫消解的濕法消解，由于濕法消解需要大量使用硝酸低溫消解有機(jī)物，對有機(jī)質(zhì)高的油脂類樣品更難消解[5-7]，需反復(fù)加酸，必要時加過氧化氫，造成樣品前處理流程長、試劑用量大，使得樣品試劑空白很難控制。而實際操作時反復(fù)加酸加熱消解，緩慢的前處理過程很難保證易揮發(fā)性的硒沒有損失，造成測定結(jié)果不穩(wěn)定。因此解決生物樣品中的有機(jī)物快速簡便消解，同時避免硒的揮發(fā)損失是提高生物樣品中微量元素硒檢測能力的前提。隨著密閉高壓和微波技術(shù)的結(jié)合，微波消解儀使生物樣品的前處理過程變得簡便快捷[8-9]，消解效果也明顯提高，同時由于是密閉消解，可以避免易揮發(fā)元素的損失，提高樣品前處理的效率和質(zhì)量。

氫化物發(fā)生原子熒光光譜法(HG-AFS)是經(jīng)典的測定地質(zhì)樣品中硒的方法，經(jīng)過多年的實際應(yīng)用，已經(jīng)能夠滿足常規(guī)土壤、巖石等樣品中含量相對較高的硒的分析需求[10]。對于生物樣品，硒的含量顯著低于地質(zhì)樣品，而且其中的有機(jī)質(zhì)殘留使HG-AFS測定時存在儀器漂移不穩(wěn)定的問題，HG-AFS的分辨率較低，已經(jīng)不能滿足微量硒的分析需求。本文分別采用濕法消解和微波消解兩種方法對樣品進(jìn)行前處理，在樣品溶液的測定工作中分別采用HG-AFS[11]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[12-15]進(jìn)行比對試驗，主要對樣品的消解時間和試劑用量方面進(jìn)行優(yōu)化選擇，確定建立適用于批量分析多種生物樣品中微量元素硒的測定方法，以解決目前常用的濕法消解存在的處理時間長、試劑用量大而且無法控制用量統(tǒng)一的問題，同時解決在敞開的試驗環(huán)境下長時間消解造成的污染問題。

1 實驗部分

1.1 儀器及工作條件

X-Series Ⅱ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)。主要工作參數(shù)見表1。

表1 ICP-MS儀器工作條件

XGY-1011A型原子熒光光譜儀(中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理地球化學(xué)勘查研究所研制)。配有特制的空心陰極燈。

ETHOS TOUCH型微波消解儀(意大利Milestone公司)。主要工作參數(shù)：固定工作頻率2450 MHz，電壓220 V，功率2.5 kW。

1.2 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液和主要試劑

硒標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：ρ(Se)=100.0 μg/mL，GBW (E)080136(深圳市森維貿(mào)易有限公司)。

硒標(biāo)準(zhǔn)過渡溶液A：ρ(Se)=2.0 μg/mL，分取標(biāo)準(zhǔn)過渡溶液A配制標(biāo)準(zhǔn)過渡溶液B[ρ(Se) =0.10 μg/mL]。

分取標(biāo)準(zhǔn)過渡溶液B配制ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.005、0.010、0.050 μg/mL。

分取標(biāo)準(zhǔn)過渡溶液B配制HG-AFS標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.0125、0.025、0.050、0.100 μg/mL。

硝酸(超純)、高氯酸(優(yōu)級純)、鹽酸(超純)：均為蘇州晶瑞公司產(chǎn)品。

雙氧水(超純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

水(電導(dǎo)率大于18 MΩ·cm，中國艾科浦頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 樣品前處理

選取國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10010～GBW 10016，分別采用經(jīng)典的濕法消解方法(硝酸-高氯酸消解)和高壓密閉微波消解法進(jìn)行前處理。對兩組樣品分別采用HG-AFS[11]和ICP-MS[12-15]進(jìn)行測定。

1.3.1 硝酸-高氯酸濕法消解

準(zhǔn)確稱取0.5000 g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10010～GBW 10016分別放入50 mL玻璃燒杯中，加入30 mL濃硝酸，蓋上表面皿，在控溫電熱板上低溫升至150℃消解有機(jī)物，待深棕色濃煙完全冒盡，溶液消解至無色后升高控溫電熱板溫度至270℃，待溶液體積蒸至5 mL后取下冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，水定容后搖勻。分取5 mL溶液到10 mL比色管中用水定容至刻度，搖勻后上ICP-MS直接測定硒的含量；將剩余的溶液轉(zhuǎn)移到50 mL玻璃燒杯中，加入3 mL高氯酸，蓋上表面皿，置于控溫電熱板上，低溫升至270℃溶礦，待高氯酸冒濃白煙后控制體積在5 mL以下，取下加10 mL 50%鹽酸定容至25 mL，搖勻、冷卻，待溶液澄清后用HG-AFS測定硒的含量。取10個空白燒杯，與樣品同時處理，測定空白值。

1.3.2 高壓密閉微波消解

準(zhǔn)確稱取0.5000 g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10010～GBW 10016，分別放入微波消解儀內(nèi)罐中。加入10 mL濃硝酸，將內(nèi)罐裝入外罐，擰緊轉(zhuǎn)子確保樣品密封，放入微波消解儀中按表2的步驟進(jìn)行消解。

表2 微波消解程序

待微波消解儀內(nèi)溫度傳感器顯示內(nèi)罐溫度低于40℃后再打開內(nèi)罐，將消解好的溶液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，水定容后搖勻。分取5 mL溶液到10 mL比色管中，水定容至刻度，搖勻后用ICP-MS直接測定硒的含量；將剩余的溶液轉(zhuǎn)移到50 mL玻璃燒杯中，加入3 mL高氯酸，蓋上表面皿，置于控溫電熱板上，低溫升至270℃溶礦，待高氯酸冒濃白煙后控制體積在5 mL以下，取下加10 mL 50%鹽酸定容至25 mL，搖勻、冷卻，待溶液澄清后用HG-AFS測定硒含量。取10個空白空罐，與樣品同時處理，測定空白值。

2 結(jié)果與討論

2.1 HG-AFS測定兩種消解方法制備溶液中的硒

經(jīng)硝酸-高氯酸濕法消解和高壓密閉微波消解兩種方法制備的樣品溶液，用HG-AFS進(jìn)行測定的結(jié)果對比見表3。測定結(jié)果表明：高壓密閉微波消解的樣品由于有機(jī)物消解得很干凈，上機(jī)過程中沒有大量的有機(jī)泡沫，對儀器和測定結(jié)果都沒有影響，測定值與標(biāo)準(zhǔn)值吻合較好；濕法消解的樣品測定時存在儀器測定結(jié)果不穩(wěn)定的問題。

表3 HG-AFS測定兩種消解方法制備溶液中的硒

兩種消解方法制備的樣品，用HG-AFS測定的空白值見表4。由于高壓密閉微波消解的樣品制備過程中所用的試劑很少，樣品空白也很低；而硝酸-高氯酸濕法消解的樣品由于試劑用量大，用量很難統(tǒng)一，造成空白偏高和不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響結(jié)果的可靠性。

表4 HG-AFS測定微波消解和濕法消解的樣品空白值

2.2 ICP-MS測定兩種消解方法制備溶液中的硒

經(jīng)硝酸-高氯酸濕法消解和高壓密閉微波消解兩種方法制備的樣品溶液，稀釋后用ICP-MS進(jìn)行測定的結(jié)果對比見表5。測定結(jié)果表明：微波消解的樣品測定結(jié)果明顯好于濕法消解的樣品，并且儀器在測定微波消解的樣品時也明顯比測定濕法消解的樣品穩(wěn)定。對于含量較低的樣品，兩組測定結(jié)果相差都較大，主要是酸度和空白都較高造成的。但I(xiàn)CP-MS的測定結(jié)果還是明顯優(yōu)于HG-AFS的測定結(jié)果。

表5 ICP-MS測定兩種消解方法制備溶液中的硒

兩種消解方法ICP-MS測定的空白值(見表6)有較大差異。微波消解處理的空白值測定值很低而且測定結(jié)果較穩(wěn)定；而濕法消解處理的空白值測定值較高，測定結(jié)果也很不穩(wěn)定。這主要是微波消解法處理樣品時定量加入少量硝酸進(jìn)行消解，避免了濕法消解反復(fù)加硝酸消解造成的試劑用量大而且不一致所帶來的試劑空白。同時，微波消解處理的時間大大短于濕法消解，消解過程中的環(huán)境影響減少到最低，降低了樣品空白值。

表6 ICP-MS測定微波消解和濕法消解的樣品空白值

2.3 生物樣品中硒的測定方法選擇

通過上述4組不同消解方法和測定方法的實驗，結(jié)果表明：在前處理過程中，由于運(yùn)用了微波消解技術(shù)，使生物樣品的消解過程由原來的硝酸濕法消解需3～5天的時間[11]縮短到現(xiàn)在的1 h左右，大大提高了工作效率，降低了勞動強(qiáng)度，更適合于批量樣品的快速分析；另外所加的酸量也由原來的幾十毫升減少到現(xiàn)在的10 mL，在降低消耗的同時也明顯降低了空白背景值，減少了試劑空白的干擾，使樣品的檢出限降低。因此，本文選擇微波消解技術(shù)制備生物樣品。

在選擇測定儀器時，進(jìn)行了HG-AFS測定和ICP-MS測定[14]的比較。由于HG-AFS測定需要將消解好的樣品溶液進(jìn)一步進(jìn)行高氯酸冒煙，鹽酸提取后才能測定，相當(dāng)于增加了樣品的前處理時間，加大了工作強(qiáng)度。同時，在測定過程中由于樣品中硒的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于地質(zhì)樣品，測定結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性都較差，尤其是低含量的樣品，偏差較大。而ICP-MS測定是在CCT模式下將消解好的樣品溶液經(jīng)稀釋定容后直接測定，簡化了樣品處理過程，相應(yīng)地減少了測定誤差和樣品空白值，測定結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性都優(yōu)于HG-AFS。因此本文選擇用ICP-MS的CCT模式測定生物樣品中的硒。

2.4 方法檢出限

用已選擇的微波消解-ICP-MS體系處理12個平行空白樣品，測定其中的硒，按檢出限計算公式LOD=3σ/K(σ為12次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)計算出方法檢出限為0.01 μg/g。該方法檢出限能夠滿足生物樣品中硒的分析需求。用HG-AFS體系處理12個平行空白樣品，測定空白樣品中的硒的方法檢出限為0.03 μg/g。顯然，ICP-MS的檢出限比HG-AFS的檢出限低。

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10010～GBW 10016各0.5000 g，采用微波消解-ICP-MS體系測定12次，取其平均值，測定結(jié)果見表7。實驗發(fā)現(xiàn)，GBW 10010、GBW 10011、GBW 10012由于含鹽量少，整體而言，大多數(shù)元素含量較低，測定時基體干擾很小，內(nèi)標(biāo)變化很小，硒含量雖然較低，但精密度(RSD)仍然可以小于4%；而GBW 10014、GBW 10015、GBW 10016的基體干擾明顯大于GBW 10010、GBW 10011、GBW 10012，這是由于樣品中有部分元素含量較高，在CCT模式下，這些基體干擾已經(jīng)被消除，因此，盡管內(nèi)標(biāo)有較大變化，但硒的測定結(jié)果很穩(wěn)定可靠，精密度(RSD)小于4%。

表7 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定結(jié)果

2.6 實際樣品分析

應(yīng)用確定的高壓密閉微波消解ICP-MS方法，對送檢的近400件水稻籽實、脫水蔬菜和茶葉樣品進(jìn)行了分析，給出的實驗測試結(jié)果用戶反饋良好，表8列出了其中10件樣品的測試結(jié)果。

表8 實際樣品的分析結(jié)果

3 結(jié)語

對于硒含量相對較低的生物樣品，本文通過采用濕法消解和微波消解兩種消解體系，HG-AFS和ICP-MS兩種測定技術(shù)進(jìn)行對比試驗，確定采用微波消解ICP-MS方法實現(xiàn)了微量硒的準(zhǔn)確測定。微波消解ICP-MS方法的檢出限為0.01 μg/g，精密度(RSD，n=12)小于4%，而HG-AFS方法的檢出限為0.03 μg/g，精密度(RSD)小于10%，微波消解ICP-MS方法明顯降低了檢出限，提高了測定精密度。

本文應(yīng)用微波消解技術(shù)處理有機(jī)物，解決了過去生物樣品需大量消耗硝酸等試劑反復(fù)進(jìn)行消解所造成的前處理時間長、分析成本高和背景值高的問題，滿足了ICP-MS測定樣品對待測溶液的酸度和低空白值的要求，可以解決應(yīng)用濕法消解-HG-AFS測定方法的檢出限受到制約、精密度和準(zhǔn)確度都較差的問題。

由于生物樣品種類繁多，各種樣品的特性千差萬別，很難用一種方法涵蓋所有類型的樣品，在試驗中發(fā)現(xiàn)富含油脂類的樣品如脂肪、花生等，微波消解過程中有高壓罐壓力過高造成泄壓的現(xiàn)象，消解效果不理想，需再次消解，在測定過程中這類樣品空白值明顯偏高，有待進(jìn)一步的試驗解決。運(yùn)用ICP-MS測定生物樣品時發(fā)現(xiàn)生物樣品的基體非常復(fù)雜，樣品含鹽量差異很大，在測定是需注意內(nèi)標(biāo)的變化，對不同種類樣品要分別測定，以減少測定誤差。

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