微弱熒光信號(hào)下對(duì)色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

高海闊，馬盛楠

（1.濱州學(xué)院 光電工程系；2.濱州學(xué)院 外語(yǔ)系，山東 濱州 256600)

微弱熒光信號(hào)下對(duì)色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

高海闊1，馬盛楠2

（1.濱州學(xué)院 光電工程系；2.濱州學(xué)院 外語(yǔ)系，山東 濱州 256600)

應(yīng)用偏最小二乘法，研究了在微弱熒光信號(hào)情況下不同的預(yù)處理方式和不同建模光譜區(qū)間對(duì)色氨酸和酪氨酸溶液濃度定量分析結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理方式采用平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作，然后建模光譜區(qū)間采用300-500nm范圍內(nèi)取極值點(diǎn)并對(duì)300-400nm進(jìn)行間隔10nm取值時(shí)得到最佳的建模效果.實(shí)驗(yàn)最終取得了良好的預(yù)測(cè)效果：酪氨酸濃度的平均預(yù)測(cè)誤差為5.9%，色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

偏最小二乘法；熒光光譜；定量分析

在天然氨基酸中，能夠在激發(fā)光照射下發(fā)射熒光的只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸.色氨酸作為人體的必須氨基酸之一，具有極其重要的生理功能，在醫(yī)學(xué)上可用于抗痙攣，在食品中常用作抗氧化劑;酪氨酸則在機(jī)體內(nèi)起激素和激素受體作用，與神經(jīng)活動(dòng)、行為以及大腦皮層的睡眠節(jié)律有關(guān).因此，利用它們的熒光特性來(lái)測(cè)定其含量具有重要的意義.然而由于氨基酸溶液濃度、測(cè)量條件等限制，熒光的信號(hào)是非常微弱的[1-3].利用微弱熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸溶液濃度同時(shí)測(cè)定一直是分析工作者的難題之一.

目前，光譜定量分析的方法主要有多元線性回歸（MLR）、逐步回歸（SMR），主成分回歸（PCR）、偏最小二乘法（PLS）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）和拓?fù)洌═opological）等.本文采用經(jīng)典的偏最小二乘法對(duì)所獲取的微弱的熒光光譜信號(hào)進(jìn)行定量分析，同時(shí)測(cè)定了色氨酸和酪氨酸的濃度，取得了滿意的效果.

1 偏最小二乘法方法原理

設(shè)有q個(gè)因變量{y1,…,yq}和p自變量{x1,…,xp}.為了研究因變量和自變量的統(tǒng)計(jì)關(guān)系，我們觀測(cè)了n個(gè)樣本點(diǎn)，由此構(gòu)成了自變量與因變量的數(shù)據(jù)表X={x1,…,xp}和Y={y1,…,yq}.偏最小二乘回歸分別在X與Y中提取出成分t1和u1(也就是說(shuō)，t1是x1,…, xp的線形組合，u1是y1,…,yq的線形組合).在提取這兩個(gè)成分時(shí)，為了回歸分析的需要，有下列兩個(gè)要求[4]：

（1）t1和u1應(yīng)盡可能大地?cái)y帶他們各自數(shù)據(jù)表中的變異信息；

（2）t1與u1的相關(guān)程度能夠達(dá)到最大.

這兩個(gè)要求表明，t1和u1應(yīng)盡可能充分的代表數(shù)據(jù)表X和Y，同時(shí)自變量的成分t1對(duì)因變量的成分u1又有最強(qiáng)的解釋能力[5].

在第一個(gè)成分t1和u1被提取后，偏最小二乘回歸分別實(shí)施X對(duì)t1的回歸以及Y對(duì)u1的回歸.如果回歸方程已經(jīng)達(dá)到滿意的精度，則算法終止；否則，將利用X被t1解釋后的殘余信息以及Y被u1解釋后的殘余信息進(jìn)行第二輪的成分提取[6].如此往復(fù)，直到能達(dá)到一個(gè)較滿意的精度為止.若最終對(duì)X共提取了m個(gè)成分t1,Λ,tm，偏最小二乘回歸將通過(guò)實(shí)施yk對(duì)t1,Λ,tm的回歸，然后再表達(dá)成yk關(guān)于原變量X1,Λ,Xm的回歸方程，k=1，2，…，q.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 樣品準(zhǔn)備

預(yù)先配制各種濃度的酪氨酸和色氨酸的溶液作為測(cè)試目標(biāo)，其濃度如表1所示.

2.2 ．試驗(yàn)系統(tǒng)的組成

本實(shí)驗(yàn)采用 AvaSpec-2048型光譜儀. AvaSpec-2048型光纖光譜儀基于AvaBench-75光學(xué)平臺(tái)，采用對(duì)稱Czerny-Turner光路設(shè)計(jì)，帶有2048個(gè)像素的SONY第二代CCD探測(cè)器.光譜儀包括光纖接頭（標(biāo)準(zhǔn)SMA接口，也可以選擇其它類型的接口）、準(zhǔn)直鏡、聚焦鏡和衍射光柵. AvaSpec-2048測(cè) 量 波 長(zhǎng) 范 圍 200-1100nm，AvaSpec-2048型光譜儀適合低亮度和高分辨率的應(yīng)用領(lǐng)域.

表1 配置的酪氨酸和色氨酸的濃度（單位:1*10-4g/m l）

激發(fā)波長(zhǎng)采用254nm，由紫外燈加254nm的濾光片配合實(shí)現(xiàn).

熒光器皿為北京金格蘭公司生產(chǎn)的石英燒杯.

2.3 光譜預(yù)處理方法

光譜預(yù)處理即數(shù)據(jù)預(yù)處理是進(jìn)行建模的一個(gè)重要階段，對(duì)每一個(gè)建模樣品，通常要用多張譜圖確定其重復(fù)性.如果同一樣品的譜圖不能被鑒定，必須用數(shù)據(jù)預(yù)處理方法使它們比較相似，以消除偏移或不同線性基線的變化.通過(guò)預(yù)處理數(shù)據(jù)，保證光譜數(shù)據(jù)和含量值之間很好的相關(guān)性.一般情況下，無(wú)法給出一個(gè)常用的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法或最適合的數(shù)據(jù)方法，而是去比較幾種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，從中找出最優(yōu)方法.

所測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度極其微弱，我們從直接測(cè)得的信號(hào)中很難看出熒光信號(hào)，信號(hào)全部被淹沒(méi)在噪聲中，如圖1（a）所示.

考慮到儀器本身的影響，我們?cè)谕耆诎档那闆r下測(cè)得儀器的響應(yīng)（以下簡(jiǎn)稱黑暗相應(yīng)），用原始信號(hào)減去黑暗響應(yīng)可得圖1（b）.從圖1（b）中可以看出，光譜圖的幅值大幅度減小，說(shuō)明我們有效地降低了噪聲的影響，再對(duì)上述結(jié)果做多次平滑處理，得到圖1（c）.

從該圖中我們基本可以看清特征峰的位置，但明顯的有基線漂移的現(xiàn)象存在，我們對(duì)各光譜做減去一條直線的處理得圖1（d）；為了更好地去除基線平移的影響，我們?cè)趯?duì)其做求一次求導(dǎo)處理，得圖1（e）；二次求導(dǎo)可以消除基線漂移的影響，經(jīng)過(guò)二次求導(dǎo)后，可得到如圖1（f）所示波形.

校正模型的建立是在比較各種分析方法的基礎(chǔ)上逐步得到改善的，試驗(yàn)首先進(jìn)行了光譜預(yù)處理方法對(duì)校正結(jié)果的比較研究，主成分?jǐn)?shù)我們采用預(yù)測(cè)誤差平方和最小時(shí)的主成分?jǐn)?shù)，光譜范圍采用300-700nm，間隔20nm取值.具體結(jié)果如下：

表2 預(yù)處理方法對(duì)建模結(jié)果的影響

圖1 各種預(yù)處理方法對(duì)譜形的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，試驗(yàn)在經(jīng)過(guò)平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作時(shí)的建模效果最好.從表2中的對(duì)比結(jié)果也可以看出，對(duì)樣品進(jìn)行的建模效果的好壞不是由一個(gè)特定的方法來(lái)確定的.有的處理方法可以改善建模效果，但有的方法不僅不能促進(jìn)建模效果，而且可能由于本身處理的特點(diǎn)而帶入噪聲等其他信息，使建模效果降低.因此，建模時(shí)應(yīng)根據(jù)不同檢測(cè)目的、樣品狀態(tài)、儀器性能等情況，選擇適宜的數(shù)據(jù)處理方法，以期獲得最佳建模效果.

2.4 光譜范圍的選擇

我們?cè)趯?duì)原始光譜做平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作的基礎(chǔ)上，進(jìn)行區(qū)間范圍選擇比較研究，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析光譜區(qū)選擇對(duì)校正結(jié)果的影響情況.

仍采用預(yù)測(cè)殘差平方和最小時(shí)的主成分?jǐn)?shù).選擇區(qū)間如下：300-1000nm區(qū)間間隔50nm取值、300-700nm區(qū)間間隔30nm取值、300-500nm區(qū)間間隔 25nm取值、300-500nm區(qū)間取極值點(diǎn)、300-500nm區(qū)間取極值點(diǎn)+300-400nm間隔10nm取值.

從表3可以看出，在經(jīng)過(guò)300-500nm范圍內(nèi)取極值點(diǎn)，再對(duì)300-400nm進(jìn)行間隔10nm取值時(shí)具有最好的建模效果.具體結(jié)果如表4.而酪氨酸和色氨酸在254nm波長(zhǎng)輻射激發(fā)的主要譜形都落在300-500nm范圍內(nèi)，因此這樣取值具有很好的合理性.

表3 建模區(qū)間對(duì)建模效果的影響

表4 偏最小二乘法在最優(yōu)建模區(qū)間時(shí)的建模結(jié)果

酪氨酸濃度的平均預(yù)測(cè)誤差為5.9%，色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

3 結(jié)論

一定濃度的酪氨酸和色氨酸的混合溶液在254nm激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)下發(fā)出極其微弱的熒光，本文基于傳統(tǒng)的偏最小二乘法，嘗試各種預(yù)處理方法和光譜范圍對(duì)該微弱的熒光光譜信號(hào)進(jìn)行處理，并取得了良好的預(yù)測(cè)效果.預(yù)處理方式采用平滑、減黑暗響應(yīng)和減直線操作，然后建模光譜區(qū)間采用300-500nm范圍內(nèi)取極值點(diǎn)并對(duì)300-400nm進(jìn)行間隔10nm取值時(shí)取得最佳的建模效果：酪氨酸濃度的平均預(yù)測(cè)誤差為5.9%，色氨酸濃度的平均誤差為8.1%.

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O657.3

A

1673-260X（2014）04-0007-03

濱州學(xué)院科研基金項(xiàng)目（BZXYQNLG201106）