熊毅俊,王朝暉,王 劍 (暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)

浮游植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分與初級(jí)生產(chǎn)者,是魚類和其他經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的直接或間接的餌料[1].傳統(tǒng)浮游植物的分類鑒定,主要借助顯微鏡觀察,但該技術(shù)需要依靠研究者豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn),并且許多微小浮游植物在顯微鏡下難以區(qū)分,很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤判斷[2].隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展,分子生物學(xué)方法已被廣泛應(yīng)用于海洋浮游植物研究[3].

變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)是根據(jù)在不同濃度的變性劑中DNA片段解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化,從而將片段大小相同而堿基組成不同的片段分開[4].國外對(duì)DGGE技術(shù)的應(yīng)用已日趨成熟,目前研究主要集中在環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析上,包括物種組成分析,群落相似度比較以及分子進(jìn)化樹分析等[5-6].DGGE技術(shù)在浮游植物群落結(jié)構(gòu)分析上的運(yùn)用較少,Wang等[7]采用甲藻的特定引物成功分析鑒定了18種實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)甲藻株系;邵娟等[8]利用DGGE技術(shù)對(duì)常見海洋赤潮藻類及赤潮水樣進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)DGGE結(jié)果與顯微鏡觀察結(jié)果具有較好的一致性;同時(shí)DGGE技術(shù)也能較好地反映淡水湖泊浮游生物群落[9].此外,利用DGGE技術(shù)還可以鑒定某些在光學(xué)顯微鏡下難以區(qū)分的超微型浮游生物[10].

大亞灣位于南海北部,是廣東省重要的養(yǎng)殖基地,也是大亞灣核電站和惠州港所在地.由于近些年該海域污染日趨嚴(yán)重,營養(yǎng)鹽狀況發(fā)生明顯變化,導(dǎo)致該海域的浮游植物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化[11].鑒于先前對(duì)大亞灣浮游植物群落結(jié)構(gòu)的研究主要集中于傳統(tǒng)方法的觀察研究,對(duì)于分子水平上的研究較為有限,僅本課題組于2011年對(duì)大亞灣浮游植物 DNA指紋進(jìn)行了初步分析[12].為了進(jìn)一步了解DGGE技術(shù)在浮游植物多樣性研究中的應(yīng)用,揭示大亞灣海域浮游植物 DNA指紋,本文采集了大亞灣海域表層水樣,對(duì)大亞灣浮游植物進(jìn)行了顯微鏡定性定量分析,并利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)浮游植物的 DNA指紋進(jìn)行了研究,以揭示DGGE技術(shù)等分子手段在浮游植物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析上的應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)的設(shè)置和樣品的采集分析

圖1 大亞灣采樣點(diǎn)的設(shè)置Fig.1 Sampling stations in Daya Bay

在大亞灣海域設(shè)置了 9個(gè)采樣點(diǎn)(圖 1),于2012年5月和6月采集表層水樣4L,用1.5%的魯格氏液固定.樣品經(jīng)靜置沉降及濃縮后,用1.2μm孔徑的濾膜(Millipore)抽濾,濾膜于-20°保存待分析.另外采集表層水樣1L,用4%的福爾馬林固定,經(jīng)濃縮后在顯微鏡下對(duì)浮游植物進(jìn)行定性定量觀察.

1.2 浮游植物總DNA的提取

將濾膜冰浴剪碎,置于 1.5mL離心管中,用UNIQ柱式植物基因組提取試劑盒(上海生工)提取總 DNA,用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果后,保存于4℃?zhèn)溆?

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?8S rDNA V3區(qū),用真核生物 V3區(qū)通用引物 F1427GC(5′-CGCCCGCCCG CGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCC CTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3')和R1616(5'-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3')[13]對(duì)提取的浮游植物總 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

PCR反應(yīng)在Applied Biosystems verityTMPCR儀中進(jìn)行,反應(yīng)體系為 30μL,包括3μL 10×反應(yīng)緩沖液、0.8μL 上、下游引物(10μmol/L)、0.8μL dNTPs(10mmol/L)、0.5μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、模板量1.5μL,最后以ddH2O補(bǔ)足體積.PCR反應(yīng)條件為94℃ 1min,94℃變性1min,65℃退火1min(每個(gè)循環(huán)降低1℃),72℃延伸1min,10個(gè)循環(huán);94℃變性1min,55℃退火 1min,72℃延伸1min,20個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min.用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),擴(kuò)增出來的目的片段大小為 210bp,大小均一,適于DGGE電泳擴(kuò)增范圍(200～600bp).

1.4 DGGE分析

取 PCR 產(chǎn)物 30μL,在 Bio-Rad公司的DcodeTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析.DGGE條件為:丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%,變性梯度 30%～70%(100%的變性劑濃度為7mol/L尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù) 40%去離子甲酰胺),先用200V電壓電泳10min,然后再用 100V電壓電泳 16h,緩沖液為 1×TAE,電泳結(jié)束后用 SYBR GREEN I染色20min,用 Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc2000TM)進(jìn)行拍照.

1.5 數(shù)據(jù)分析

DNA指紋圖譜用Quantity one軟件分析,其中各站點(diǎn)的條帶光密度值強(qiáng)度低于 0.05將被排除,對(duì)各站點(diǎn)的條帶進(jìn)行標(biāo)記并進(jìn)行相似度分析,以Pearson系數(shù)0.5作為聚類臨界點(diǎn),最后采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對(duì)圖譜進(jìn)行聚類分析[14].

顯微鏡觀察結(jié)果用Spss19軟件進(jìn)行聚類分析,為了減少不同浮游植物物種數(shù)量的差異,對(duì)浮游植物細(xì)胞密度進(jìn)行了自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換.采用組間聯(lián)接的聚類方法,平方Euclidean距離的度量方法對(duì)9個(gè)不同站點(diǎn)進(jìn)行聚類.

2 結(jié)果

2.1 DNA指紋圖譜

圖2 大亞灣表層浮游植物18S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜Fig.2 DGGE fingerprints of 18S rDNA V3 region of phytoplankton in surface layer of Daya Bay

圖3 浮游植物18S rDNA V3區(qū)DGGE圖譜分析帶型圖Fig.3 DGGE profile analysis of 18S rDNA V3 region of phytoplankton

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳,DGGE電泳圖譜顯示各站點(diǎn)浮游植物的DNA指紋(圖2).較亮的條帶為優(yōu)勢(shì)種,而同一水平位置的條帶則代表同一物種.結(jié)果顯示,浮游植物DGGE圖譜條帶清晰,各站點(diǎn)之間優(yōu)勢(shì)種既有交叉又有所差異.用Quantity one軟件分析得到的DGGE帶型圖能更清楚顯示出DNA指紋圖譜(圖3),5月份浮游植物DGGE圖譜中共有26條不同條帶,各站點(diǎn)條帶數(shù)為5～17條,S3站點(diǎn)條帶最多,S5和S2站點(diǎn)較少(圖3a).其中條帶9在所有站點(diǎn)中均出現(xiàn),條帶7、8、11在8個(gè)站點(diǎn)中出現(xiàn),而條帶2、3、10、13也是常見優(yōu)勢(shì)條帶.6月份浮游植物DGGE電泳圖譜共發(fā)現(xiàn) 28條帶,每個(gè)站點(diǎn)條帶數(shù)為 7～24條(圖3b),其中S2站點(diǎn)最多,S5站點(diǎn)最少.與5月份相比,6月份優(yōu)勢(shì)條帶更為豐富,條帶數(shù)更多.而其中S2站點(diǎn)變化最大,條帶數(shù)由5月份的5條增加至6月份的24條.

2.2 浮游植物群落結(jié)構(gòu)

硅藻是大亞灣浮游植物的主要類群,其次為甲藻(圖4),還存在少量綠藻和藍(lán)細(xì)菌.5月份和6月份9個(gè)站點(diǎn)硅藻分別占浮游植物總數(shù)29.0%～99.4%和 7.9%～99.9%,平均分別為 85.0%和77.1%.5月份和6月份浮游植物平均細(xì)胞密度相差不大,分別為3.84×105cells/L 和 6.05×105cells/L.5月份細(xì)胞豐度最高的是 S1,為 1.08×106cells/L;S7浮游植物密度較低,為1.17×104cells/L.6月份細(xì)胞密度最高的是 S3,為2.06×106cells/L;S5細(xì)胞密度最低,為9.7×104cells/L.優(yōu)勢(shì)種硅藻包括環(huán)紋婁氏藻(Lauderia annulata)、丹麥細(xì)柱藻(Leptocylindrus danicus)、擬菱形藻(Pseudo-nitzschia spp.)、菱形海線藻(Thalassionema nitzschioides)、冰河擬星桿藻(Asterionellopsisglacialis)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、細(xì)弱海鏈藻(Thalassionema subtilis)、角毛藻(Chaetoceros spp.)、小環(huán)藻(Cyclotella spp.)等.優(yōu)勢(shì)甲藻主要為小型裸甲藻屬(Gymnodinium spp.)和反曲原甲藻(prorocentrum sigmoides).

5月份反曲原甲藻在S5大量出現(xiàn),在甲藻和浮游植物中的百分比含量分別為92.2%和65.5%.6月份裸甲藻在S3、S7中大量出現(xiàn),該藻在甲藻和浮游植物中的百分比含量分別為 99.4%和91.6%以及99.1%和47.2%.2種甲藻的大量出現(xiàn)導(dǎo)致了甲藻在這些站點(diǎn)的百分比含量明顯高于其他站點(diǎn),而且在5月份S5以及6月份S3中甲藻的百分比含量均超過了50%.此外,在6月份S8的浮游植物組成與其他站點(diǎn)也具有明顯差別,主要表現(xiàn)在其他藻類百分比的上升,這主要是由于在該樣品中,藍(lán)細(xì)菌中的色球藻(Chroococcus spp.)的大量出現(xiàn),導(dǎo)致了以該藻為主的其他藻類百分比上升為59.9%.

圖4 各站點(diǎn)不同類別浮游植物的數(shù)量百分比Fig.4 Quantitative percentages of different groups of phytoplankton in each station

2.3 浮游植物種類與DNA指紋條帶的比較

圖5可以明顯看出,顯微觀察分析得到的浮游植物種類數(shù)明顯高于DGGE條帶數(shù).在5月份和6月份的2次調(diào)查中,共分析鑒定出浮游植物72種,其中5月份為52種,每個(gè)站點(diǎn)鑒定的種類數(shù)為 12～26種;6月份共分析鑒定出浮游植物 54種,每個(gè)站點(diǎn)鑒定的種類數(shù)為12～30種.

圖5 浮游植物顯微觀察種類數(shù)及DGGE指紋條帶數(shù)的比較Fig.5 Comparison between species number and DGGE fingerprint bands of phytoplankton

為了避免DGGE分析中浮游植物優(yōu)勢(shì)種類對(duì)稀有種類的屏蔽作用,將百分比含量小于0.1%的種類進(jìn)行剔除,再與 DNA指紋條帶數(shù)進(jìn)行比較.結(jié)果顯示,種類數(shù)與 DNA指紋條帶數(shù)變化規(guī)律基本一致(圖 5),說明 DGGE分析能在一定程度上反映浮游植物的種類多樣性.5月份優(yōu)勢(shì)種的種類數(shù)都高于DNA指紋條帶數(shù),這是由于5月份樣品中各站點(diǎn)細(xì)胞密度最高的優(yōu)勢(shì)種均為擬菱形藻(Pseudo-nitzschia spp.),它們的百分比含量均超過 80%,而其他所有非優(yōu)勢(shì)種的百分比較低.因此 DNA 擴(kuò)增過程中,擬菱形藻很有可能對(duì)其他密度較低的非優(yōu)勢(shì)種存在屏蔽效應(yīng).而6月份優(yōu)勢(shì)種類數(shù)則與DNA條帶數(shù)相近甚至低于條帶數(shù).一方面是由于6月份浮游植物均勻度較高,優(yōu)勢(shì)種相對(duì)含量較少,而種類較為豐富,優(yōu)勢(shì)種類產(chǎn)生的屏蔽作用也較小;另一方面可能由于顯微觀察較難區(qū)分形態(tài)結(jié)構(gòu)類近的同屬種類,而在DNA指紋圖譜中卻能將同屬不同種類的浮游植物分離.

2.4 浮游植物群落以及DNA指紋聚類分析

圖6 根據(jù)浮游植物DGGE指紋圖譜的聚類分析圖Fig.6 Clustering dendrogram of sampling station based on DGGE fingerprints of phytoplankton

從DGGE指紋圖譜得到的聚類分析結(jié)果與各站點(diǎn)的地理位置具有一定關(guān)系(圖1,圖6).近岸海域的站點(diǎn)如S2、S3、S6之間相似度高,聚為一類;而遠(yuǎn)岸海域如 S1、S4、S5、S7、S8、S9聚在一起(圖 6a)或者單獨(dú)為一類(圖 6b).說明浮游植物 DNA植物具有一定的空間分布規(guī)律.而通過浮游植物群落進(jìn)行聚類分析結(jié)果與DGGE指紋聚類結(jié)果相近(圖7),澳頭近岸海域的S2和S3總是聚在一起,其余較為遠(yuǎn)岸站點(diǎn)聚成一大類.

圖7 根據(jù)浮游植物群落豐度和種類數(shù)的聚類分析Fig.7 Clustering dendrogam of sampling stations based on cell abundance and species richness of phytoplankton community

3 討論

大亞灣夏季浮游植物種類豐富,共分析鑒定出浮游植物 72種;DNA指紋條帶也比較豐富,2個(gè)月份分別得到 26和 28條不同條帶.一般來說,DNA指紋條帶數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于浮游植物種類數(shù),但是剔除非優(yōu)勢(shì)種后,DNA條帶數(shù)與種類數(shù)變化趨勢(shì)相近(圖5).結(jié)果說明DNA指紋圖譜能較大程度地反映浮游植物優(yōu)勢(shì)種群的組成,而對(duì)于相對(duì)含量較少的物種,可能會(huì)由于優(yōu)勢(shì)種的屏蔽作用而被掩蓋.作為一種分子手段, DGGE技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確地分析群落結(jié)構(gòu)多樣性,彌補(bǔ)顯微觀察中一些難以區(qū)分的種類以及微小物種的分離鑒定[10].在本研究中,6月份的某些樣品中DNA指紋數(shù)要高于優(yōu)勢(shì)種類數(shù),說明對(duì)某些相對(duì)含量＞0.1%的優(yōu)勢(shì)物種,DGGE技術(shù)對(duì)浮游植物物種的區(qū)分度要比顯微鏡分析更為精確.另一方面,由于DGGE技術(shù)本身所存在的缺陷,電泳過程中容易發(fā)生共遷移現(xiàn)象[15-16],造成堿基組成相近的DNA片段區(qū)分困難,一條DNA條帶中有時(shí)可能存在幾個(gè)相近物種的 DNA指紋;此外,對(duì)于較少的非優(yōu)勢(shì)種,由于DNA含量極少,在后續(xù)的PCR擴(kuò)增中,會(huì)被數(shù)量較高種類的 DNA所掩蓋,導(dǎo)致其無法在DGGE圖譜中出現(xiàn).針對(duì)出現(xiàn)的這些技術(shù)缺陷,目前的解決方法是將條帶切膠回收測(cè)序,通過是否可獲得單一的序列來判斷條帶攜帶的遺傳信息.由此說明 PCR-DGGE技術(shù)在分析浮游植物群落結(jié)構(gòu)上具有一定的可行性.

通過聚類分析發(fā)現(xiàn),顯微鏡觀察的聚類結(jié)果與 DNA指紋的聚類分析結(jié)果較為一致,能較為清楚地將富營養(yǎng)化嚴(yán)重的近岸海域和較為清潔的遠(yuǎn)岸海域區(qū)分開來(圖6).由于生活污水排放以及大規(guī)模的養(yǎng)殖,南澳以及大鵬澳近岸海域富營養(yǎng)化嚴(yán)重,營養(yǎng)鹽含量高[17].本研究結(jié)果顯示,靠近養(yǎng)殖區(qū)的站點(diǎn)S2、S3、S6浮游植物生物量豐富,甲藻數(shù)量明顯增多,說明富營養(yǎng)化已經(jīng)對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重影響.遠(yuǎn)岸海域的幾個(gè)站位雖然所處的海域不同,離岸遠(yuǎn)近也有些差異,但是沒有處于富營養(yǎng)化嚴(yán)重的養(yǎng)殖區(qū)域,這幾個(gè)站位的浮游植物群落結(jié)構(gòu)和 DNA指紋均相近,在聚類分析中也聚為一大類.本研究結(jié)果說明,營養(yǎng)化程度是影響大亞灣海域浮游植物分布的重要原因.此外,位于核電站附近的 S5站點(diǎn)浮游植物種類、數(shù)量以及DNA指紋條帶數(shù)均較低,核電站溫排水可能也是影響浮游植物群落結(jié)構(gòu)的重要因素,特別是在夏季高溫季節(jié)[18].

此外,6月份S8樣品中發(fā)現(xiàn)有大量的藍(lán)細(xì)菌,細(xì)胞密度達(dá)到 1.28×105cells/L,約占細(xì)胞總密度的60%.藍(lán)細(xì)菌是地球的先鋒生物,具有抗高溫、抗紫外以及抗攝食能力[19],隨著水溫、紫外輻射的增加以及富營養(yǎng)化的加劇,藍(lán)細(xì)菌水華已經(jīng)成為全球水環(huán)境的巨大挑戰(zhàn)[20].大亞灣海域也已出現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌數(shù)量上升趨勢(shì)[18],而在本研究中出現(xiàn)的大量藍(lán)細(xì)菌更進(jìn)一步說明了大亞灣海域浮游植物群落結(jié)構(gòu)有向藍(lán)細(xì)菌演變的趨勢(shì).但是在DNA指紋圖譜研究中,由于PCR擴(kuò)增中使用的引物為真核生物通用引物,未能將藍(lán)細(xì)菌 DNA擴(kuò)增出來.因此,在以后的 DNA指紋圖譜研究中需要設(shè)計(jì)藍(lán)細(xì)菌的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而更全面了解浮游植物的DNA指紋和分子多樣性.

4 結(jié)論

4.1 DGGE技術(shù)能較好地反映浮游植物優(yōu)勢(shì)種群多樣性,在顯微觀察中,一些難以區(qū)分的種類以及微小物種的分離鑒定都可以通過DGGE技術(shù)得到解決,但是對(duì)于一些相對(duì)含量較少的種類,其遺傳信息可能會(huì)被優(yōu)勢(shì)種類所屏蔽.

4.2 近海岸富營養(yǎng)化對(duì)大亞灣海域浮游植物群落結(jié)構(gòu)影響較大,浮游植物種類和細(xì)胞密度相對(duì)其他海域較高,而在靠近核電站的附近海域中,核電站溫排水對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)具有一定影響.

4.3 大亞灣海域某些站點(diǎn)出現(xiàn)了大量的藍(lán)細(xì)菌和裸甲藻,存在引發(fā)赤潮的風(fēng)險(xiǎn),在今后的DNA指紋分析中需要對(duì)原核微型浮游植物進(jìn)行研究.

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