吳本麗,曹 巖,羅 思,王劍偉 (1.中國科學(xué)院水生生物研究所,湖北 武漢 430072；2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

國際上對化學(xué)品的生產(chǎn)、進(jìn)口及使用等均已形成了相應(yīng)的許可制度和法律法規(guī).我國對有毒化學(xué)品的進(jìn)出口也進(jìn)行了嚴(yán)格控制,先后頒布了《新化學(xué)物質(zhì)環(huán)境管理辦法》、《化學(xué)品測試導(dǎo)則》等法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn),要求新化學(xué)物質(zhì)申報(bào)需“在中國境內(nèi)用中國的供試生物完成的生態(tài)毒理學(xué)特性測試報(bào)告”.出于化學(xué)品環(huán)境管理和維護(hù)我國生態(tài)安全的需要,本土生物毒性測試技術(shù)體系成為亟待解決的問題.在我國化學(xué)品毒性測試推薦的試驗(yàn)用魚中,稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)是唯一的我國特有魚種,有關(guān)其毒性測試的國家標(biāo)準(zhǔn)正在研究中.

稀有鮈鯽是一種小型鯉科魚類,因具有生長周期短、產(chǎn)卵批次多等生物學(xué)特征使其成為一種理想的實(shí)驗(yàn)魚材料[1],現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到胚胎學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域,尤其是在環(huán)境毒理學(xué)研究方面[3-8].過去我國所用的稀有鮈鯽實(shí)驗(yàn)魚,多是野生個(gè)體的后代,無明確繁育體系和品系背景.為了促進(jìn)實(shí)驗(yàn)用魚來源和種源的標(biāo)準(zhǔn)化,中國科學(xué)院水生生物研究所先后建立了稀有鮈鯽的近交系(HAN)和封閉群(Ihb:IHB)[9-12].封閉群是指在不從外部引入新個(gè)體的條件下,以非近親交配的方式至少繁殖 4代以上而得到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體[13].由于封閉群動(dòng)物遺傳組成較接近于自然狀態(tài)下的動(dòng)物群體結(jié)構(gòu),就個(gè)體而言,封閉群動(dòng)物在遺傳上具有高度的雜合性;就整體而言,封閉群的遺傳特性又保持相對穩(wěn)定,因此封閉群十分適合生態(tài)毒理學(xué)研究和毒性測試[14].對稀有鮈鯽封閉群的生物學(xué)及遺傳質(zhì)量監(jiān)測表明,封閉群與野生種群在形態(tài)特征、臟器系數(shù)以及生長和繁殖指標(biāo)上均無明顯差異,且保持了野生群體的遺傳多樣性,各代間遺傳特性也比較穩(wěn)定[12].然而關(guān)于稀有鮈鯽封閉群對化學(xué)品的敏感性還缺乏研究,該群體是否可作為化學(xué)品測試的種源尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.本文選擇重鉻酸鉀、五氯酚、氯化汞、對氯苯胺、氯化鎘等幾種常見的具有危害性的化學(xué)品進(jìn)行毒性測試,以此來評價(jià)IHB應(yīng)用于毒性測試的敏感性和適宜性,為促進(jìn)稀有鮈鯽毒性測試技術(shù)體系的標(biāo)準(zhǔn)化及應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 受試生物

稀有鮈鯽野生群(WG)于2011年10月采自四川漢源縣,體長為(26.5±2.3)mm,體重(0.292±0.02)g,實(shí)驗(yàn)前在室內(nèi)馴養(yǎng) 2周以上.封閉群稀有鮈鯽為中國科學(xué)院水生生物研究所培養(yǎng)的 IHB第 6 代個(gè)體,體長(25.7±1.9)mm,體重(0.267±0.01)g;用于 7d亞慢性毒性測試和胚胎-卵黃囊吸收階段試驗(yàn)的受精卵和仔魚均來自該封閉群.

1.2 實(shí)驗(yàn)用水及化學(xué)藥品

實(shí)驗(yàn)中所用稀釋水采用分析純和去離子水配制,總硬度為(250.4±20)mg/L,以 CaCO3計(jì)(GB 7477-87).重鉻酸鉀(K2Cr2O4,基準(zhǔn)工作試劑,99.95%～100.05%,中國國藥上?；瘜W(xué)試劑公司),儲(chǔ)備液濃度10g/L,濃度以Cr6+計(jì).五氯酚(PCP,分析純,＞99%,美國 Sigma公司),用二甲基亞砜(DMSO)配制成10.0g/L,現(xiàn)配現(xiàn)用.氯化汞(HgCl2,分析純,≥99.5%,貴州省銅仁市云場坪化工礦產(chǎn)經(jīng)營部),儲(chǔ)備液濃度 1.0g/L,濃度以 Hg2+計(jì).對氯苯胺(ClC6H4NH2,分析純,98%,ACROS ORCANICS 公司),儲(chǔ)備液用丙酮配制成 1.0g/L.氯化鎘(Cadmium Chloride,CdCl2,分析純,100%,ACROS ORCANICS 公司),儲(chǔ)備液濃度10.0g/L,濃度以Cd2+計(jì).

1.3 實(shí)驗(yàn)控制條件

急性毒性試驗(yàn)容器為 20cm×20cm×20cm規(guī)格的無縫玻璃缸,實(shí)測承載量約 0.5g/L.亞慢性毒性試驗(yàn)容器為直徑 12cm 的玻璃結(jié)晶皿,容積約500mL.試驗(yàn)容器均浸泡在水浴中,實(shí)測溫度為(25.2±0.20)℃;試驗(yàn)期間光暗周期 12h:12h;試驗(yàn)水體溶氧為 7.02～7.85mg/L, pH 7.35～8.19.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 96h急性毒性測試 參考《化學(xué)品測試方法》[15],通過觀察實(shí)驗(yàn)過程中受試魚的反應(yīng)和死亡情況等,分析稀有鮈鯽對幾種常見化學(xué)品的敏感程度.實(shí)驗(yàn)前將受試魚置于實(shí)驗(yàn)相同條件下暫養(yǎng)7d,暫養(yǎng)期間每天投喂2次,實(shí)驗(yàn)前1d停止投喂,實(shí)驗(yàn)期間不投喂.實(shí)驗(yàn)開始按低濃度到高濃度的順序隨機(jī)并快速的將受試魚轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)缸,轉(zhuǎn)移過程在15min以內(nèi),初放入30min內(nèi)持續(xù)觀察,其后每1h觀察一次,12h后根據(jù)受試魚的實(shí)際反應(yīng)情況適當(dāng)延長觀察時(shí)間間隔.每隔 24h按低濃度到高濃度順序更換一半實(shí)驗(yàn)液,更換前后測定pH值、溶氧等水質(zhì)指標(biāo).記錄實(shí)驗(yàn)期間不同藥物濃度下實(shí)驗(yàn)魚的異常反應(yīng)、死亡情況、水質(zhì)變化等,并及時(shí)撈出死亡個(gè)體.

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定受試魚全部死亡的最低濃度和全部存活的最高濃度,以此來設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)濃度范圍,按幾何級數(shù)設(shè)置試驗(yàn)濃度組(表 1).為了進(jìn)行直觀比較,野生群和封閉群對比實(shí)驗(yàn)采用相同的濃度梯度;由于野生個(gè)體數(shù)量有限,故未對其開展 Cd2+和對氯苯胺急性毒性試驗(yàn).預(yù)實(shí)驗(yàn)規(guī)模為5尾/缸,不設(shè)平行組;每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器盛放實(shí)驗(yàn)液5L,正式實(shí)驗(yàn)10尾/缸.每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,并設(shè)空白對照.其中五氯酚實(shí)驗(yàn)增加助溶劑DMSO對照組,各組用DMSO配平使助溶劑一致,實(shí)驗(yàn)液中最終助溶劑添加量為0.015mL/L.

表1 96h急性毒性測試濃度梯度Table 1 The concentration gradient of 96h acute toxicity test

1.4.2 胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試 參照《化學(xué)品測試方法》和OECD魚類胚胎-卵黃囊吸收階段的短期暴露試驗(yàn)方法進(jìn)行[15-16].解剖鏡下觀察胚胎早期發(fā)育,取受精成功 8h(約原腸胚期)的胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn).對氯苯胺濃度組分別為1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0mg/L及對照組, Cd2+濃度組分別為0.05,0.10,0.20,0.40,0.80mg/L及對照組,同一濃度設(shè)3個(gè)平行.每個(gè)結(jié)晶皿盛放400mL實(shí)驗(yàn)液,隨機(jī)放入30枚受精卵,每24h更換一次實(shí)驗(yàn)液.觀察記錄各實(shí)驗(yàn)容器中的死亡受精卵和仔魚數(shù)及仔魚的畸形情況,并及時(shí)挑出死亡個(gè)體.實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到某一濃度組卵黃囊被完全吸收時(shí)結(jié)束,實(shí)驗(yàn)周期 7～8d,實(shí)驗(yàn)期間不投喂.實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活個(gè)體用100mg/L的MS-222麻醉后測量體長,記錄畸形情況;安樂死后的仔魚在104 ℃下6h烘干后用1/105g電子天平稱量干重.

1.4.3 7d亞慢性毒性測試 參照 USEPA黑頭軟口鰷7d亞慢性毒性試驗(yàn)[17]及有關(guān)稀有鮈鯽的亞慢性毒性試驗(yàn)文獻(xiàn)進(jìn)行[3,13].實(shí)驗(yàn)用魚為孵化后1d表現(xiàn)正常的仔魚,一次實(shí)驗(yàn)采用同對親魚所產(chǎn)的同批魚卵孵化的仔魚.實(shí)驗(yàn)所用換水方法及實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)與胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試相同.每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器盛放受試仔魚 15尾,每天投喂2次豐年蟲無節(jié)幼體,投喂30min后清除殘餌,將死魚挑出并作記錄,實(shí)驗(yàn)持續(xù) 7d,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前12h停止投喂,將各試驗(yàn)容器存活個(gè)體麻醉,在解剖鏡下測量體長;安死后的仔魚在104 ℃下6h烘干后用1/105g電子天平稱量干重.

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析,主要得出24,48,72,96h的半致死濃度及95%置信區(qū)間等,采用經(jīng)驗(yàn)公式推算安全濃度,SC=0.1×96h LC50,通過t檢驗(yàn)比較不同化學(xué)品對不同來源稀有鮈鯽半致死濃度的差異性.采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett’S多重比較得出各組孵化率、仔魚畸形率、累計(jì)死亡率、體長和體重的差異等.數(shù)據(jù)分析中所用濃度為設(shè)置濃度.

2 結(jié)果

2.1 急性毒性測試

2.1.1 中毒表現(xiàn) 急性毒性試驗(yàn)的對照組均未發(fā)現(xiàn)死亡和行為異常的情況,某些暴露組中的實(shí)驗(yàn)魚出現(xiàn)了明顯的中毒癥狀.重鉻酸鉀暴露時(shí)魚體出現(xiàn)了浮游水面、呼吸急促等類似浮頭的現(xiàn)象,其后魚動(dòng)作遲緩,身體逐漸失去平衡,各鰭從端部向根部漸漸潰爛、甚至脫落.五氯酚、對氯苯胺、氯化汞和氯化鎘暴露時(shí)的中毒表現(xiàn)與此類似,所不同的是實(shí)驗(yàn)魚死亡時(shí),身體有不同程度的彎曲,頜及鰓蓋多呈張開狀態(tài),鰭基部有充血現(xiàn)象等.

將急性毒性測試后的存活個(gè)體放入標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中飼喂觀察7d,其中重鉻酸鉀實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)明顯中毒癥狀的個(gè)體在 7d內(nèi)基本死亡,損傷無法恢復(fù);未出現(xiàn)死亡情況的低濃度組個(gè)體基本存活,但活動(dòng)能力較對照組弱.氯化汞實(shí)驗(yàn)高濃度組的存活個(gè)體有部分死亡,少量存活,低濃度組存活個(gè)體基本存活.PCP實(shí)驗(yàn)各個(gè)濃度的存活個(gè)體在放入標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中飼喂后基本能存活,且活動(dòng)狀態(tài)良好.

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間 稀有鮈鯽對不同藥物的反應(yīng)時(shí)間有所不同,封閉群和野生群對同一種藥物的反應(yīng)時(shí)間也有所不同.在不同濃度 PCP暴露下,野生群和封閉群受試個(gè)體死亡基本都發(fā)生在實(shí)驗(yàn)開始 48h內(nèi);而對于重鉻酸鉀和氯化汞,在8～96h內(nèi)均有個(gè)體死亡的情況發(fā)生(表2).

表2 稀有鮈鯽野生群和封閉群對3種化學(xué)品的急性毒性反應(yīng)時(shí)間(h)Table 2 The response time of wild group and Ihb:IHB under different chemicals in 96h acute toxicity test (h)

2.1.3 效應(yīng)濃度 由于實(shí)測濃度在設(shè)置濃度的 90%～110%范圍內(nèi),因此直接按設(shè)置濃度計(jì)算LC50和SC(表3).稀有鮈鯽對5種化學(xué)品的敏感性從高到低的順序?yàn)镠g2+＞ PCP ＞ Cd2+＞ 對氯苯胺 ＞ Cr6+.對比野生群和封閉群在同一濃度梯度下不同時(shí)間的半致死濃度,只有重鉻酸鉀暴露下有所差異(P＜0.05),Hg2+和 PCP無明顯差異(P＞0.05).總體看來,稀有鮈鯽封閉群對上述 3種化學(xué)藥品的敏感性不亞于野生群(表 3).

表3 稀有鮈鯽野生群和封閉群對幾種化學(xué)品的半致死濃度及95%置信區(qū)間Table 3 The LC50 and 95% confidence interval of acute toxicity test on wild group and Ihb:IHB respectively

2.2 胚胎-卵黃吸收階段及7d亞慢性毒性測試

2.2.1 中毒表現(xiàn) 對氯苯胺實(shí)驗(yàn)中胚胎時(shí)期出現(xiàn)胚胎發(fā)育遲緩、仔魚畸形等情況.畸形仔魚的表現(xiàn)有:脊柱彎曲、卵黃囊吸收延遲鰾充氣延遲或鰾不充氣、圍心腔水腫、難以自由游動(dòng),活動(dòng)能力差等.氯化鎘對稀有鮈鯽胚胎和仔魚產(chǎn)生致畸和致死作用,畸形主要表現(xiàn)與對氯苯胺實(shí)驗(yàn)相似,如脊柱C形或S形彎曲等.

2.2.2 毒性效應(yīng) 胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試中,從仔魚畸形率看,對氯苯胺1.0～4.0mg/L濃度組與對照組均無顯著性差異,8.0,16.0和32.0mg/L濃度組與對照組差異顯著.隨濃度升高,仔魚的畸形率會(huì)明顯上升,由畸形率確定的最低無抑制濃度(NOEC)、最低有影響濃度(LOEC)和最大容許濃度(MATC)分別為 4.0,8.0和 5.66mg/L.從實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仔魚的平均體長和平均體重來看,1.0和2.0mg/L濃度組與對照組均無顯著性差異,4.0mg/L濃度組開始與對照組之間差異顯著,由此確定的NOEC、LOEC和MATC分別為2.0,4.0,2.83mg/L(表4).7d亞慢性毒性測試中,從死亡率情況來看,1.0～8.0mg/L濃度組與對照組之間無顯著性差異,16.0,32.0mg/L濃度組與對照組之間差異顯著.從試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仔魚的平均體長和干重的情況來看,1.0～4.0mg/L濃度組與對照組之間無顯著性差異,8.0～32.0mg/L濃度組與對照組之間差異顯著(表5),隨著對氯苯胺濃度的增加,稀有鮈鯽仔魚的死亡率增大,生長也受到非常明顯的影響.由死亡率確定的NOEC、LOEC和MATC分別為 8.0,16.0,11.31mg/L,由仔魚的平均體長和平均體重確定的NOEC、LOEC和MATC分別為4,8,5.66mg/L.

表4 對氯苯胺和氯化鎘對封閉群稀有鮈鯽胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試結(jié)果Table 4 Effect of p-Chloroaniline and CdCl2on hatching rate, abnormality rate, mortality and growth of G.rarus

表5 對氯苯胺和氯化鎘對封閉群稀有鮈鯽的7d亞慢性毒性影響Table 5 Effects of p-Chloroaniline and CdCl2 on mortality and growth under 7-day subchronic toxicity test on larvae

當(dāng)胚胎-卵黃囊吸收階段暴露于不同濃度的氯化鎘時(shí),孵化率在0.05mg/L濃度組與對照組間無顯著性差異(P＞0.05),0.10mg/L濃度組開始與對照組差異顯著;當(dāng)濃度為0.05mg/L和0.1mg/L時(shí)仔魚畸形率與對照組無顯著性差異,0.20～0.80mg/L濃度組與對照組之間存在顯著差異,從實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仔魚的平均體長和平均體重來看,0.05和0.10mg/L濃度組與對照組均無顯著性差異,0.20mg/L濃度組開始與對照組之間差異顯(表4);由畸形率和生長確定NOEC、LOEC和MATC均為0.10,0.20,0.14mg/L;7d亞慢性測試中,由0.2mg/L濃度組開始至0.8mg/L濃度組仔魚的平均體長和干重與對照組有顯著性的差異,隨著鎘離子濃度的升高,仔魚的生長受到很明顯的影響(表 5),由此推算的NOEC、LOEC和 MATC分別為 0.10,0.20,0.14mg/L.

3 討論

3.1 急性毒性測試

結(jié)果表明,封閉群稀有鮈鯽對幾種化學(xué)品參比物的敏感性不亞于其他常見實(shí)驗(yàn)魚種[2,18-22].將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與2006年重鉻酸鉀和五氯酚對稀有鮈鯽毒性測試數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),其半致死濃度與本試驗(yàn)結(jié)果沒有明顯差異.2006年進(jìn)行重鉻酸鉀和五氯酚的急性毒性測試的受試魚為實(shí)驗(yàn)室繁育的普通后代(圖1),說明稀有鮈鯽封閉群作為受試魚進(jìn)行毒性測試的敏感性較高且穩(wěn)定,并有著有良好的重復(fù)性和可操作性.

圖1 2011年野生群和封閉群與2006年野生群后代對重鉻酸鉀和五氯酚96h半致死濃度對比Fig.1 The 96h LC50of wild group, Ihb:IHB and offspring of wild group respectively in 2011and 2006 on Cr6+and PCP

20世紀(jì) 70年代關(guān)于金魚和黑頭軟口鰷對PCP的急性毒性試驗(yàn)表示,在一定范圍內(nèi),不同年齡、不同規(guī)格受試魚的半致死濃度相差不大[23].在本實(shí)驗(yàn)中,稀有鮈鯽也存在相似情況,野生群個(gè)體大小差異相對較大,日齡不確定,在同一個(gè)暴露濃度下,死亡情況隨機(jī)發(fā)生,與受試魚個(gè)體大小沒有明顯關(guān)系.周永欣等[4]對 2～24d稀有鮈鯽進(jìn)行急性毒性測試顯示,2,12,24日齡稀有鮈鯽對PCP的 96h LC50分別為 103.3,70.1,113.2μg/L;對 30日齡,體長為(9.5±2)mm的稀有鮈鯽進(jìn)行PCP的96h毒性測試得到 LC50為 81μg/L[21],對超過 2月齡體長為(20±3)mm的稀有鮈鯽96h LC50為101.5μg/L[18],本研究野生群受試魚體長為(26.5±2.3)mm,封閉群受試魚體長為(25.7±1.9)mm(均大于 2月齡),對 PCP的 96h LC50分別為 105.6,111.5μg/L.總體看來,不同日齡和不同個(gè)體大小的稀有鮈鯽對PCP的敏感性存在一定差異,但對于30日齡以上的實(shí)驗(yàn)魚,LC50的差異并不大.

事實(shí)上,在化學(xué)品測試的應(yīng)用中,除了敏感性外,可重復(fù)性和可操作性也是測試技術(shù)體系需要關(guān)注的問題.已有研究表明,稀有鮈鯽的早期發(fā)育大致需要1個(gè)月左右,在這期間,仔魚的器官逐漸發(fā)育,化學(xué)品可能對某些階段的發(fā)育影響較大[24],當(dāng)使用30日齡以下的仔魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),不同大小(日齡)的個(gè)體處于不同的發(fā)育期,容易導(dǎo)致結(jié)果的差異.而 1～3月齡的稀有鮈鯽,除了性腺之外,各器官均已發(fā)育完成,對化學(xué)品的敏感性相對穩(wěn)定,適合用于毒性測試.考慮到在飼養(yǎng)、運(yùn)輸以及實(shí)驗(yàn)操作等方面的便利性,作者建議采用全長(30±10)mm(相應(yīng)的體長為24mm左右)的魚作為96h急性毒性測試用魚.

3.2 胚胎-卵黃囊吸收階段及 7d亞慢性毒性測試

胚胎-卵黃囊吸收階段和 7d亞慢性毒性測試都屬于短期暴露試驗(yàn)(表6),以魚類的早期生活史階段為材料,觀測致死和亞致死毒性效應(yīng).對于稀有鮈鯽而言,這2個(gè)試驗(yàn)試驗(yàn)周期相近,但試驗(yàn)魚所處的發(fā)育期不盡相同,因而在可操作性、觀測指標(biāo)等方面有一些差異.胚胎-卵黃囊吸收階段毒性測試以卵黃囊吸盡為終點(diǎn),通常包括胚胎期 3d和卵黃囊仔魚期 4d,試驗(yàn)的觀測指標(biāo)主要包括孵化率,畸形率、死亡率、平均體長和干重等.7d亞慢性毒性測試的實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)為初孵不久的仔魚,試驗(yàn)周期 7d,實(shí)際包括卵黃囊仔魚期 3～4d以及晚期仔魚3～4d,試驗(yàn)周期內(nèi)仔魚由內(nèi)源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)為外源性營養(yǎng),成功攝食是仔魚進(jìn)一步發(fā)育和存活的關(guān)鍵[24-25].7d亞慢性毒性測試的觀測指標(biāo)主要包括死亡率、平均體長和干重等.胚胎期可能對有毒物質(zhì)十分敏感,但是在亞慢性毒性測試中,其毒性效應(yīng)不一定能從孵化率、胚胎畸形率等表觀指標(biāo)上反映出來.本研究的結(jié)果表明,除對 Cd2+的試驗(yàn)中孵化率指標(biāo)較為敏感外,其余試驗(yàn)中均以生長指標(biāo)(平均體長和干重)最為敏感,且2種亞慢性毒性測試的靈敏度相當(dāng).此外,從本文的結(jié)果以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)來看[18,26-27],生長指標(biāo)的靈敏度要高于死亡率指標(biāo),而平均體長和干重所確定的效應(yīng)濃度基本相同.本研究表明,體長指標(biāo)是稀有鮈鯽亞慢性試驗(yàn)中最方便的觀測指標(biāo),與胡煒等[26]研究結(jié)果一致.

從實(shí)驗(yàn)的操作性來看,胚胎卵黃囊吸收階段試驗(yàn)的起點(diǎn)為受精卵,一般在受精后8h內(nèi)即開始試驗(yàn),通常需要實(shí)驗(yàn)室專門飼養(yǎng)親魚才能進(jìn)行該試驗(yàn),對于小型實(shí)驗(yàn)室而言,實(shí)驗(yàn)存在成本和技術(shù)上的難題;而且,由于稀有鮈鯽卵具有較強(qiáng)的粘性,在分組等操作時(shí)既費(fèi)時(shí)又容易導(dǎo)致受精卵損傷,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果.7d亞慢性毒性測試一般從孵出后 24h內(nèi)開始實(shí)驗(yàn),受精卵或仔魚可以從繁育中心運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室,因而材料獲取上更為廣泛.與胚胎卵黃囊吸收階段試驗(yàn)相比,7d亞慢性毒性測試需正常飼養(yǎng)的方式投喂豐年蟲幼體,在豐年蟲卵的來源與保存、孵化方法、投喂操作等方面沒有制約性的困難.因?yàn)橥段沽耸澄?對照組或未受到毒性影響的仔魚生長較快,從生長指標(biāo)上觀測毒性效應(yīng)更為方便;同時(shí),仔魚的攝食率也可能成為潛在的觀測指標(biāo).目前,在《化學(xué)品測試方法》以及已經(jīng)頒布的有關(guān)化學(xué)品生態(tài)毒理學(xué)測試標(biāo)準(zhǔn)中考慮了胚胎卵黃囊吸收階段試驗(yàn),但未納入7d亞慢性毒性試驗(yàn),因此,后者更具有可操作性和推廣前景,應(yīng)加強(qiáng)稀有鮈鯽亞慢性毒性試驗(yàn)方法的優(yōu)化,制定相關(guān)的技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn).

表6 胚胎-卵黃囊吸收階段和7d亞慢性毒性測試的比較Table 6 The comparison of short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages and 7-day standard reference toxicant test

4 結(jié)論

4.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,稀有鮈鯽封閉群(IHB)對Hg2+、五氯酚、 Cd2+、對氯苯胺和Cr6+等化學(xué)品敏感,對Hg2+、PCP和Cr6+的敏感性不亞于野生群體.對 PCP、Cr6+的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好.

4.2 胚胎-卵黃囊吸收階段和7d亞慢性毒性測試結(jié)果表明,Cd2+和對氯苯胺暴露后封閉群在孵化率、畸形率、死亡率、生長等方面均表現(xiàn)出毒性效應(yīng),其中體長生長指標(biāo)較敏感并方便觀察.兩種試驗(yàn)的靈敏度相近,7d亞慢性毒性測試更具有可操作性和推廣前景.

4.3 稀有鮈鯽封閉群 IHB適合于作為化學(xué)品生態(tài)毒理學(xué)測試的種源.使用封閉群作為測試生物,有助于在種源、種質(zhì)、繁育及供應(yīng)等方面促進(jìn)稀有鮈鯽毒性測試技術(shù)體系的標(biāo)準(zhǔn)化,提高測試質(zhì)量.

[1]曹文宣,王劍偉.稀有鮈鯽-一種新的魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 [J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理, 2003,S1:96-99.

[2]周永欣,成水平,胡 煒,等.稀有鮈鯽-一種新的魚類毒性實(shí)驗(yàn)材料 [J].動(dòng)物學(xué)研究, 1995a,16(1):59-63.

[3]周永欣,成水平,胡 煒.稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)7d亞慢性毒性試驗(yàn) [J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 1995b,15(3):375-380.

[4]MA-Taowu, WANG-Zijian, LIU-Jiankang.Endocrine disrupting effects on Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) fed with field collected Limnodrilus sp.[J].Journal of Environmental Sciences,2004,16(5):784-787.

[5]周群芳,傅建捷,孟海珍,等.水體硝基苯對日本青鳉和稀有鮈鯽的亞急性毒理學(xué)效應(yīng) [J].中國科學(xué) B輯:化學(xué), 2007,37(2):197-206.

[6]駱堅(jiān)平,馬 梅,劉 操,等.用沉積物、稀有鮈鯽和生物模擬采樣器評價(jià)水體中PAHs和OCPs的生物富集和有效性 [J].環(huán)境科學(xué), 2009,30(2):610-615.

[7]LI-Wei, ZHA-Jinmiao, LI-Zhaoli et al.Effects of exposure to acetochlor on the expression of thyroid hormone related genes in larval and adult rare minnow (Gobiocypris rarus) [J].Aquatic Toxicology, 2009,94:87-93.

[8]YUAN-Cong, ZHANG-Yingying, HU-Guojun et al.Expression of two zona pellucida genes is regulated by 17alphaethinylestradiol in adult rare minnow Gobiocypris rarus [J].Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology and Pharmacology, 2013,158(1):1-9.

[9]王劍偉,王 偉,崔迎松.野生和近交稀有鮈鯽的遺傳多樣性 [J].生物多樣性, 2000,8(3):241-247.

[10]LIAO-Xiaolin, WANG-Dang, YU-Xiaomu, et al.Characterization of novel microsatellite loci in rare minnow(Gobiocypris rarus) and amplification in closed related species in Gobioninae [J].Conserv.Genet., 2007,8:1003-1007.

[11]邵 燕,王劍偉,何勇鳳,等.稀有鮈鯽近交系微衛(wèi)星多態(tài)性分析[J].水生生物學(xué)報(bào), 2009,33(4):650-655.

[12]顧黨恩,王劍偉.應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對稀有鮈鯽封閉群建群過程中的遺傳監(jiān)測 [J].水生生物學(xué)報(bào), 2012,36(2):197-203.

[13]方葉喜,邢瑞昌,賀爭鳴.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制 [M].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出社, 2008:126-150.

[14]賀爭鳴,李冠民.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法概論 [M].北京:學(xué)苑出版社, 2008,257-263.

[15]國家環(huán)境保護(hù)總局《化學(xué)品測試方法》編委會(huì).化學(xué)品測試方法 [G].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2004:188-237.

[16]Guideline for testing of chemicals 212: fish, short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages.OECD, 2001 [S].

[17]Environmental response team standard operating procedures 7-day standard reference toxicant test using larval pimephales promelas.USEPA 2006 [S].

[18]姜福全.稀有鮈鯽急性、亞慢性毒性試驗(yàn)方法及其在東湖底泥毒性研究中的應(yīng)用 [D].武漢:中科院水生生物研究所, 2007.

[19]潘厚軍,吳淑勤,黃志斌,等.不同體征規(guī)格、性別的劍尾魚對重鉻酸鉀和馬拉硫磷的敏感性試驗(yàn) [J].淡水漁業(yè), 1996,26(增刊):83-871.

[20]盧 玲,沈英娃.酚類、烷基苯類、硝基苯類化合物和環(huán)境水樣對劍尾魚和稀有鮈鯽的急性毒性 [J].環(huán)境科學(xué)研究, 2002,15(4):57-59.

[21]宋志慧,王慶偉,楊魯娜,等.三苯基錫和五氯酚對斑馬魚急性毒性作用和過氧化物酶活性的影響 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,39(20):12202-12204.

[22]端正花,張斌田,朱 琳.雙酚A對斑馬魚胚胎發(fā)育階段的毒性及生物蓄積 [J].中國環(huán)境科學(xué), 2008,28(3):260-26.

[23]Adelman I R, Smith L L, Siesennop G D.Effect of size or age of goldfish and fathead minnows on use of pentachlorophenol as a reference toxicant [J].Water Research, 1976,10(8):685-687.

[24]王劍偉,宋天祥,曹文宣.稀有鮈鯽胚后發(fā)育和幼魚生長的初步研究 [J].水生生物學(xué)報(bào), 1998,22(2):128-134.

[25]王劍偉,喬 曄,陶玉玲.稀有鮈鯽仔魚的攝食和耐饑餓能力 [J].水生生物學(xué)報(bào), 1995,19(2):97-103.

[26]胡 煒,成永平,周永欣.稀有鮈鯽亞慢性毒性試驗(yàn) [J].水生生物學(xué)報(bào), 1998,22(4):336-340.

[27]王朝暉,尹伊偉,許忠能,等.8種擬除蟲菊酯農(nóng)藥對稀有鮈鯽的急性、亞慢性毒性研究 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 1998,4(4):379-382.