姜 宏,左利民,周 潔,鄔旭然,山廣志

(1.煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所,北京 100050)

蘋(píng)果是薔薇科蘋(píng)果屬植物的果實(shí),營(yíng)養(yǎng)豐富,具有多種保健功效．氨基酸是蘋(píng)果風(fēng)味的主要組成物質(zhì),具有增鮮和提高機(jī)體免疫力的作用,蘋(píng)果的質(zhì)量與其所含氨基酸的種類(lèi)、含量和組成密切相關(guān)[1]．微量元素、氨基酸[2]及糖、可溶性固形物等指標(biāo)性成分采用聚類(lèi)分析、主成分分析[3]等數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法處理后,可用于地域性分析及品質(zhì)鑒別[4]．

氨基酸的分析方法主要有氨基酸分析儀測(cè)定法[5]、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培法(HPAEC-IPAD)[6]、氣質(zhì)聯(lián)用[7]、毛細(xì)管電泳[8]、液質(zhì)聯(lián)用[9],這些儀器一般比較昂貴,不利于普及和應(yīng)用．高效液相色譜法[10]操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、價(jià)格低廉,已普遍用于多種生物樣品內(nèi)氨基酸的檢測(cè)．由于大多數(shù)氨基酸不含生色基團(tuán),在高效液相色譜法中需要通過(guò)衍生化的方法將氨基酸轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)紫外或者熒光吸收的衍生物進(jìn)行測(cè)定．常用的氨基酸衍生劑包括鄰苯二甲醛(OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、異硫氰酸苯酯(PITC)等.OPA具有衍生步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快、剩余試劑不干擾測(cè)定的特點(diǎn),將FMOC與OPA聯(lián)用可同時(shí)檢測(cè)一級(jí)和二級(jí)氨基酸,衍生化反應(yīng)可在室溫下進(jìn)行,衍生化效率高,適合在線(xiàn)衍生[11],已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥中氨基酸的檢測(cè)[12-13]．

煙臺(tái)是我國(guó)著名的蘋(píng)果產(chǎn)地,目前有關(guān)煙臺(tái)蘋(píng)果中游離氨基酸組成及含量的研究比較少．本研究以O(shè)PA和FMOC為衍生劑,采用在線(xiàn)衍生-反相高效液相色譜法,對(duì)煙臺(tái)境內(nèi)不同產(chǎn)地及生長(zhǎng)環(huán)境下紅富士蘋(píng)果中游離氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定,采用主成分分析和聚類(lèi)分析對(duì)蘋(píng)果的地域性和品質(zhì)進(jìn)行了初步鑒定,為煙臺(tái)蘋(píng)果功效成分、地域性及品質(zhì)特征的進(jìn)一步研究提供參考．

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

1200型液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司,配有在線(xiàn)脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器);CP214電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司);Seven easy pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司).

1.2 試劑與材料

17種氨基酸混合對(duì)照品溶液(購(gòu)自Agilent公司,濃度分別為1 000、250、100、25、10 pmol/μL),批號(hào)分別為:BCBC6065,BCBG846V,BCBG3084V,BCBG3086V,BCBG8467V;甲醇、乙腈均為市售色譜級(jí);磷酸氫二鈉、四硼酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純．

樣品:2012年煙臺(tái)產(chǎn)紅富士蘋(píng)果,分別取自煙臺(tái)境內(nèi)蓬萊劉家溝A(施用稀土微肥)、劉家溝B(不施用稀土微肥,下同)、牟平莒格莊、牟平觀水、棲霞桃村、牟平高陵、龍口諸由觀、牟平龍泉,編號(hào)依次為1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8．

1.3 色譜條件

色譜柱為Capcell PAK C18色譜柱(Agilent,4.6 mm×150 mm,3 μm),流動(dòng)相A為10 mmol的Na2HPO4,Na2B4O7(pH 8.2),流動(dòng)相B:45%甲醇45%乙腈10%水．流速1.5 mL/min,柱溫40℃,檢測(cè)波長(zhǎng):分時(shí)間變波長(zhǎng)檢測(cè),0～17 min為338 nm,17～25 min為262 nm．進(jìn)樣量:程序進(jìn)樣．

線(xiàn)性梯度(流動(dòng)相B): 0 min(2%)→0.5 min(2%)→20.0 min(57%)→20.1 min(100%)→23.5 min(100%)→23.6 min(2%)→25.0 min(2%).

1.4 衍生方法

利用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行在線(xiàn)自動(dòng)衍生．衍生程序:(1)吸取硼酸鹽緩沖液2.5 μL;(2)吸取待測(cè)樣品溶液(對(duì)照品溶液或供試品溶液)1.0 μL;(3)在空氣中以最大速度混合5次,混合體積3.5 μL;(4)等待0.2 min;(5)吸取OPA衍生劑 0.5 μL;(6)在空氣中以最大速度混合10次,混合體積4.0 μL;(7)吸取FMOC衍生劑 0.4 μL;(8)在空氣中以最大速度混合10次,混合體積4.4 μL;(9)吸取進(jìn)樣溶劑32 μL;(10)在空氣中以最大速度混合8次,混合體積20 μL;(11)衍生后的樣品注入液相色譜儀．

1.5 游離氨基酸供試品的制備

參照文獻(xiàn)[14-15]方法并進(jìn)行了改進(jìn)．取同一產(chǎn)地蘋(píng)果樣本5個(gè),去皮去核,準(zhǔn)確稱(chēng)取40 g果肉,混合,榨汁．將果汁于-75 ℃冷凍,然后置于60 ℃水浴融解,重復(fù)3次,使細(xì)胞充分破碎,果渣轉(zhuǎn)移至漏斗中,用超純水洗至茚三酮不顯色．合并果汁和清洗液,濃縮后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用超純水稀釋至刻度．

1.6 數(shù)據(jù)處理

以8個(gè)產(chǎn)地的紅富士蘋(píng)果作為自變量,17種氨基酸含量作為因變量,通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析．

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線(xiàn)性關(guān)系 取濃度分別為1 000、250、100、25、10 pmol/μL的混合氨基酸對(duì)照溶液進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系考察,分別進(jìn)樣測(cè)試,記錄色譜圖．以濃度(x,μg/mL)對(duì)峰面積(y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,分別計(jì)算17種氨基酸的回歸方程(表1)．

表1 17種游離氨基酸的線(xiàn)性考察結(jié)果

2.1.2 日內(nèi)精密度 取1號(hào)樣品溶液,在擬定的色譜條件下重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算各氨基酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(表2)．結(jié)果表明,方法的日內(nèi)精密度良好,測(cè)定結(jié)果的RSD均小于4%(n=6)．

2.1.3 回收率 取8號(hào)樣品,選取含量差異較大的Asp、Ala、Tyr 進(jìn)行方法回收率實(shí)驗(yàn)．分別按實(shí)際含量的80%,100%和120%的量添加對(duì)照品,平行測(cè)定3次,結(jié)果見(jiàn)表3．結(jié)果表明,擬定方法能夠滿(mǎn)足蘋(píng)果中游離氨基酸測(cè)定的要求,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠．

表2 方法日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

* 回收率=(測(cè)得量-實(shí)際量)/加入量×100%

2.2 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的煙臺(tái)紅富士蘋(píng)果樣本,按照1.5項(xiàng)下方法處理后,按擬定方法檢測(cè)并計(jì)算游離氨基酸含量．氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及1號(hào)蘋(píng)果樣品測(cè)定圖譜見(jiàn)圖1和圖2,煙臺(tái)境內(nèi)不同產(chǎn)地紅富士蘋(píng)果樣品中游離氨基酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4．

由表4可知,4號(hào)蘋(píng)果樣品中氨基酸總量最高,7號(hào)和8號(hào)次之,1號(hào)蘋(píng)果樣施用了稀土肥,必需氨基酸所占的比例最高,達(dá)到29.5%．

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定色譜圖

圖2 1號(hào)供試品測(cè)定色譜圖

煙臺(tái)紅富士蘋(píng)果中酸性氨基酸含量較高,堿性氨基酸較少．含量較高的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、丙氨酸、異亮氨酸，與紅富士蘋(píng)果“口感酸爽”的特點(diǎn)相一致．

不同產(chǎn)地紅富士蘋(píng)果中組氨酸含量差別較小,其他氨基酸如絲氨酸、 甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸等含量差別較大,這些氨基酸的含量可作為區(qū)分不同產(chǎn)地紅富士蘋(píng)果的參考指標(biāo)之一．

2.3 聚類(lèi)分析

以紅富士蘋(píng)果樣本中游離氨基酸的含量為變量,將氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果以歐氏距離(Euclidean Distance)作為測(cè)度準(zhǔn)則,以組間連接法作為組群合并原則,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)煙臺(tái)各地的蘋(píng)果進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果如圖3所示．

圖3 紅富士蘋(píng)果中游離氨基酸聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

當(dāng)歐式距離為20時(shí),所測(cè)煙臺(tái)蘋(píng)果樣品大致分為3類(lèi):5(棲霞)、6(牟平高陵)、2(蓬萊劉家溝B)、7(龍口諸由觀)為一類(lèi);1(蓬萊劉家溝A)、3(牟平莒格莊)、4(牟平觀水)為一類(lèi);8(牟平龍泉)為一類(lèi)．

2.4 主成分分析

以17種游離氨基酸的含量為依據(jù),對(duì)8個(gè)產(chǎn)地的蘋(píng)果樣進(jìn)行主成分分析(圖4),分別求得對(duì)應(yīng)于2個(gè)最大特征值的主成分PC1(Ser,His,Gly,Thr,Arg,Ala,Cystine,Val,Phe,Ile,Leu,Lys),PC2(Asp,Glu,Pro),兩者的貢獻(xiàn)率分別為50.26%,21.48%,累積貢獻(xiàn)率達(dá)71.74%, 基本可以代表全部氨基酸信息．

圖4 各產(chǎn)地紅富士蘋(píng)果對(duì)第一主成分和第二主成分的散點(diǎn)圖

利用不同氨基酸主成分得分之間的關(guān)系,對(duì)蘋(píng)果產(chǎn)地進(jìn)行分類(lèi)．各地蘋(píng)果可劃分為3個(gè)區(qū)域:5,6,2,7號(hào)樣為一區(qū)域,這類(lèi)蘋(píng)果第一主成分得分較低,第二主成分得分適中;1,3,4號(hào)樣為一區(qū)域;這類(lèi)蘋(píng)果第一主成分適中,第二主成分偏低;8號(hào)樣為一區(qū)域,該類(lèi)蘋(píng)果第二主成分得分較高．

煙臺(tái)境內(nèi)不同產(chǎn)地紅富士蘋(píng)果游離氨基酸含量的主成分分析結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致．綜合2項(xiàng)分析的結(jié)果以及蘋(píng)果樣本采集地域的情況,可做如下分析和推論:① 蓬萊和龍口臨海,樣本采集地相距較近,氣候條件相似,故蘋(píng)果樣本特性比較相近．② 采集自蓬萊劉家溝的1號(hào)蘋(píng)果樣本施用了稀土肥,氨基酸組成及含量與周邊地域有較大的改變．③ 棲霞桃村位于內(nèi)陸,高陵處于牟平中部的,兩者地理位置接近,受海洋性氣候影響較小,蘋(píng)果性質(zhì)更接近．④ 處于牟平東南部和南部的莒格莊和觀水,地理位置較為接近,蘋(píng)果差異性小一些,分析結(jié)果與施用稀土肥的蓬萊劉溝蘋(píng)果歸為一類(lèi)．⑤ 牟平龍泉三面環(huán)山,一面臨湖,地理環(huán)境及土壤條件均具有特點(diǎn),被單獨(dú)歸為一類(lèi)．

3 結(jié) 論

煙臺(tái)紅富士蘋(píng)果中含有較豐富的氨基酸,其中必需氨基酸7種,半必需氨基酸3種,藥效氨基酸8種．必需氨基酸占氨基酸總量的比例為6.6%～29.5%,蓬萊劉溝A的樣本中必需氨基酸含量最高,牟平龍泉次之．各地氨基酸總量47.0～140.9 μg/g,藥效氨基酸占總氨基酸含量47.8%～72.5%．

煙臺(tái)紅富士蘋(píng)果含有的游離氨基酸中,天門(mén)冬氨酸和谷氨酸兩種酸性氨基酸含量較高,此外還含有較高的絲氨酸、丙氨酸、異亮氨酸,與煙臺(tái)紅富士蘋(píng)果“口感酸爽”的特征相符．

煙臺(tái)境內(nèi)不同產(chǎn)地的紅富士蘋(píng)果由于生長(zhǎng)的具體環(huán)境以及地理環(huán)境的不同,在游離氨基酸的組成及含量等指標(biāo)上存在一定的地域差異,經(jīng)聚類(lèi)分析和主成分分析,可將收集到的八種煙臺(tái)紅富士蘋(píng)果大致聚為3類(lèi),并在一定程度上反應(yīng)了地域概念．

由于蘋(píng)果果實(shí)品質(zhì)受主觀因素如:栽植條件、肥水管理水平等影響較大,因此同一產(chǎn)區(qū)的蘋(píng)果也可能表現(xiàn)出較大的差異性．通過(guò)對(duì)這些相關(guān)影響因素的進(jìn)一步研究,勢(shì)必將提升紅富士蘋(píng)果品質(zhì)的認(rèn)識(shí)．為煙臺(tái)紅富士蘋(píng)果作為地理標(biāo)志產(chǎn)品以及煙臺(tái)蘋(píng)果的品質(zhì)鑒定提供初步依據(jù)．

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