岑峰 嚴(yán)強(qiáng) 張國雷 倪俊 袁文斌 魏云海

急性胰腺炎(AP)早期存在微循環(huán)障礙，這些微循環(huán)的變化與胰腺病變的嚴(yán)重程度及血液中胰酶升高的水平呈正相關(guān)[1-2]。參麥注射液具有抑制內(nèi)皮素-1的表達(dá)與釋放、抑制血小板聚集、抑制血栓素合成、促進(jìn)前列環(huán)素產(chǎn)生等作用，因此具有改善局部微循環(huán)，增加血管通透性及抗氧化等藥理作用。本研究應(yīng)用參麥注射液治療急性水腫性胰腺炎(acute edematous pancreatitis, AEP)大鼠，觀察AEP大鼠微循環(huán)及炎癥反應(yīng)的變化，探討其相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用參麥注射液提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康成年雄性SD大鼠(由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)60只，日齡80～90 d，體質(zhì)量(200±50)g。按完全隨機(jī)法分為參麥治療組(參麥組)和AEP組，每組30只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，稱重后采用雨蛙素50 μg·kg-1·h-1連續(xù)7次腹腔內(nèi)注射、每次間隔1 h的方法建立大鼠AEP模型。造模后1 h給予5%水合氯醛0.35 g/kg體質(zhì)量腹腔注射誘導(dǎo)麻醉，繼以0.1 g·kg-1·h-1維持麻醉。參麥組從尾靜脈內(nèi)緩慢滴注參麥注射液(5 ml·kg-1·d-1)進(jìn)行治療；AEP組給予等容積生理鹽水緩慢滴注。造模前1 d和造模后1 h及1、3、5、7 d眼內(nèi)眥交替采血，每次2 ml。7 d時(shí)處死兩組大鼠各15只，14 d處死剩余大鼠，留取胰腺組織樣本備用。另選取正常大鼠3只，留取胰腺組織備用。

二、方法

1．血清淀粉酶、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)測定：采用ELISA法檢測血清淀粉酶、PAF、VEGF的含量，試劑盒購自上海勁馬生物科技有限公司，按說明書操作。

2．胰腺組織NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)檢測：應(yīng)用總RNA快速提取試劑盒(Generay公司)抽提胰腺組織總RNA。采用實(shí)時(shí)RT-PCR方法檢測NF-κB mRNA表達(dá)量。NF-κB引物正義序列為ACGGGGAAGGTCTGAATGC，反義序列為GGTGTCGTCCCATCGTAGGT，產(chǎn)物223 bp；內(nèi)參GAPDH正義序列為AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反義序列為AGGGGCCATCCACAGTCTTC，產(chǎn)物258 bp。引物的設(shè)計(jì)和合成由上海英駿生物有限公司完成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；qPCR試劑IQ SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司。mRNA相對表達(dá)量采用2-△△Ct公式計(jì)算。

取新鮮胰腺組織，裂解制備組織勻漿，離心取上清。蛋白定量后行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB蛋白表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參。兔抗鼠NF-κB、β-actin一抗， 山羊抗兔IgG二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

3．胰腺組織微血管密度(micro vessel density, MVD) 計(jì)數(shù)：胰腺組織固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用SP法檢測CD31的陽性表達(dá)。參照Weidner等[3]方法量化計(jì)算MVD。每張切片先在低倍鏡下尋找血管高密度集中的區(qū)域，然后在高倍鏡(×250)下選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)MVD。任何一個(gè)與周圍其他組織有明顯界限、胞質(zhì)呈棕染的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，無論有無管腔、無論管腔內(nèi)有無紅細(xì)胞均定義為一個(gè)微血管；凡管腔直徑>8個(gè)紅細(xì)胞或管壁有明顯肌層及纖維硬化、炎癥及壞死的微血管均不計(jì)入總數(shù)。取5個(gè)視野的平均值作為該標(biāo)本的MVD。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、兩組大鼠死亡率

大鼠造模后7 d內(nèi)均無死亡，7～14 dAEP組死亡4只，參麥組死亡3只，死亡率分別為13.3%和10.0%，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)。

二、血清淀粉酶、PAF、VEGF含量的變化

兩組大鼠造模后1 h血清淀粉酶活性及PAF、VEGF含量即升高，較術(shù)前的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為178.258、158.258、11.258，P值均<0.01)。造模后3、5、7 d參麥組血淀粉酶活性及PAF含量逐漸下降，且較AEP組下降顯著，兩組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為37.195、9.916、8.276、4.106、7.570、10.780，P<0.05或<0.01)；血清VEGF含量逐漸升高，且較AEP組升高顯著，兩組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.356、3.357、11.241，P<0.05或<0.01，表1)。

表1 參麥組和AEP組大鼠制模前后血清淀粉酶、PAF、VEGF含量的變化

三、兩組大鼠胰腺組織NF-κB表達(dá)量的變化

正常胰腺組織NF-κB mRNA表達(dá)量為0.169±0.012。造模后7、14 d AEP組胰腺組織NF-κB mRNA表達(dá)量分別為1.000±0.059、0.762±0.047，參麥組為0.834±0.031、0.438±0.024；AEP組NF-κB蛋白表達(dá)量分別為0.93±0.45、0.44±0.20，參麥組為0.49±0.24、0.21±0.11(圖1)。參麥組的表達(dá)均較AEP組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.646、21.097、3.341、3.458，P值均<0.05)。

圖1 參麥組和AEP組大鼠胰腺組織NF-κB蛋白的表達(dá)

四、兩組大鼠胰腺組織的MVD

CD31陽性表達(dá)定位于胰腺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色(圖2)。術(shù)后7、14 d參麥組大鼠胰腺組織的MVD分別為6.41±1.14、9.03±2.55，AEP組分別為3.62±0.89、3.22±1.92，參麥組顯著高于AEP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為7.471、6.127，P值均<0.01)。

討 論

大量研究表明，AP發(fā)病機(jī)制與胰酶自身消化、微循環(huán)障礙、胰管屏障的破壞、氧自由基、炎癥遞質(zhì)及多種細(xì)胞因子的作用相關(guān)，而胰腺炎從局部病變迅速發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官衰竭可能與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和免疫功能紊亂相關(guān)[4]。隨著對AP微循環(huán)障礙認(rèn)識的深入，通過改善微循環(huán)可以減輕胰腺細(xì)胞的損傷和壞死，進(jìn)一步減輕胰腺炎時(shí)全身多臟器微循環(huán)障礙，同時(shí)阻止多器官功能衰竭綜合征的發(fā)生和發(fā)展[5]。

圖2 AEP組7、14 d(a、b)及參麥組7、14 d(c、d)大鼠胰腺組織CD31的表達(dá)(免疫組化染色 ×250)

PAF是一種強(qiáng)效生物活性磷脂，具有促進(jìn)血管通透性增加、血小板活化、氧自由基大量釋放等作用，從而導(dǎo)致血栓形成，微循環(huán)障礙，加重組織損傷。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，PAF在AP的發(fā)病過程中起著重要作用，PAF的表達(dá)量與AP病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[6-7]。VEGF是血管新生中最重要的刺激因子，能特異性地促進(jìn)血管生成。

NF-κB在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用。NF-κB的過度活化會激活、增強(qiáng)機(jī)體的非特異及特異性免疫反應(yīng)，造成組織損傷和器官功能紊亂。Telek等[8]認(rèn)為，AP早期腺泡細(xì)胞氧自由基大量形成并造成細(xì)胞損傷與NF-κB的激活密切相關(guān)。Kim等[9]應(yīng)用抗氧化劑治療AP后能夠抑制腺泡細(xì)胞NF-κB的活性，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕腺泡細(xì)胞損傷，表明活性氧在介導(dǎo)刺激物激活NF-κB的過程中起重要作用，抗氧化劑可作為NF-κB抑制劑。參麥注射液是由人參與麥冬精制而成的純中藥制劑，其有效成分為人參皂苷和人參多糖。參麥注射液可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管舒張因子以擴(kuò)張血管、增加血流，并促進(jìn)血管生成以改善微循環(huán)，還可減少炎癥遞質(zhì)的釋放，抑制炎癥因子活性，減輕炎癥反應(yīng)，此外，還具有抗氧化功效，因此，本研究采用參麥注射液治療AEP大鼠，探討其治療AP的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，AEP造模后大鼠血清PAF、VEGF含量升高，胰腺組織NF-κB基因表達(dá)及MVD增加。參麥注射液治療后大鼠血清PAF含量、胰腺組織NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)量及MVD均較AEP組顯著下降，而VEGF含量較AEP組顯著升高，表明參麥注射液治療AEP大鼠具有改善組織微循環(huán)，促進(jìn)血管新生，緩解急性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胰腺炎病程恢復(fù)的作用。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Gloor B, Blinman TA,Rigberg DA, et al. Kupffer cell blockade hepatic and systemic cytokine levels and lung injury in hemorrhagic pancreatitis in rats[J]. Pancreas, 2000, 21(4): 414-420.

[2] Meager MD, Plusczyk T, Vollmar B. Microcirculatory derangements in acute pancreatitis[J]. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 2001, 8(3): 187-194.

[3] Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognosis indicator in early-stage breast carcinoma[J]. J Natl Cancer Inst, 1992,84(24):1875-1887.

[4] Pezzilli R. Acute recurrent pancreatitis: an autoimmune disease[J]? World J Gastroenterol, 2008, 14(7): 999-1006.

[5] 于洪亮，鄭榮哲，楊維良. 重癥急性胰腺炎微循環(huán)障礙的治療現(xiàn)狀[J]. 國際外科學(xué)雜志，2007,10(34):685-688.

[6] Formela LJ, Wood LM, Whittaker M, et al. Amelioration of experimental a cute pancreatitis with a potent platelet-activating factor antagonist[J]. Br J Surg, 1994, 81(12): 1783-1785.

[7] Jankowski A, Jankowska B, Niedworok J. The influence of Aronia melanocaprar in experimental pancreatitis[J]. Pol Merkur Lekarski, 2000, 8(48): 395-398.

[8] Telek G, Ducroc R, Scoazec JY, et al. Differential upregulation of celluar adhesion molecules at the site of oxidative stress in experimental acute pancreatitis[J]. J Surge Res, 2001,96(1):56-67.

[9] Kim H, Seo JY, Roh KH, et al. Suppression of NF-kappa B activation and cytokine production by N-acetylcysteine in pancreatic acinar cells[J]. Free Radic Biol Med, 2000, 29(7): 674-683.