袁 琳，寧 丹，唐曦陽，李 晶

(中南民族大學 藥學院，武漢 430074)

常見的細菌計數(shù)方法有比濁法、平板菌落計數(shù)法、血球板計數(shù)法等.比濁法和血球計數(shù)法均能較快的反應細菌數(shù)，但不能判斷細菌的活性，易受培養(yǎng)基成分和代謝產物性質等的影響[1-3].平板菌落計數(shù)法操作復雜、重復性差、耗時長，不適于大批量實驗.

MTT 法簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定[4]，能準確的反應活細胞相對數(shù)目，目前已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗和腫瘤放射敏感性測定等[3, 5-7].MTT 比色法其檢測原理為利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)，并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，以甲臜生成量與活細胞數(shù)量的關系來判斷活細胞數(shù)量，OD 值越大，細胞活性越強[2,8,9].三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶在真核細胞中主要存在線粒體中，而在原核細胞中主要存在膜間，故MTT 法也可用來檢測活細菌數(shù)量[10].

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是重要的微生物研究材料，也是重要的食品污染指示菌.本實驗以金黃色葡萄球菌為對象，探討MTT 法應用于活細菌細胞數(shù)定量分析的可行性和檢測條件.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

金黃色葡萄球菌(ACTT 25923)，由本室保存.胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、紅霉素、MTT 等(Ameresco,美國).MH肉湯(青島高科園海博生物技術有限公司)，氯化鈉、二甲亞砜、無水乙醇為國產分析純.

酶標儀(Multiskan ascent，Thermo Electron Corporation)，臺式恒溫振蕩器(THZ-B，江蘇太倉市實驗設備廠)，潔凈工作臺(SW-CJ-2FD，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH3600B，天津市泰斯特儀器有限公司).

1.2 菌種的活化

將保存在固體培養(yǎng)基上的金黃色葡萄球菌株接種于MH液體培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min過夜培養(yǎng)進行初級活化.將活化好的初級菌種按2.5%的接種量進行二級活化，于37℃，180 r/min繼續(xù)培養(yǎng) 6～8 h，使其達到對數(shù)生長期，用于后續(xù)實驗.

1.3 吸光度范圍的確定

將菌懸液用培養(yǎng)基倍比稀釋，于595 nm下直接測定各孔的吸光度，或加入MTT 溶液于37℃作用3 h后以DMSO溶解，于570 nm 波長下測定各孔的吸光度.設6個復孔，重復3次，下同.

1.4 DMSO 用量的對吸光度值的影響

將制備好的菌懸液加入96孔培養(yǎng)板中，MTT溶液作用3h 后，分別加入1～3倍菌液體積的DMSO，于570 nm下檢測不同用量DMSO 對吸光度值的影響.分別以培養(yǎng)基、菌懸液、菌懸液+ MTT、菌懸液+不同劑量的DMSO 為對照，于570 nm下測定各孔的吸光度.

1.5 MTT 作用濃度對吸光度值的影響

將制備好的菌懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，分別加入濃度為0.05～1.0 mg/mL的MTT 溶液于 37 ℃下恒溫培養(yǎng)3 h后加入DMSO 200 μL，于570 nm下測定各孔的吸光度.

1.6 MTT 作用時間對吸光度值的影響

將制備好的菌懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，加入MTT 溶液于37 ℃恒溫培養(yǎng)0.5～4 h后加入DMSO 200 μL，于570 nm 波長下測定各孔的吸光度.

1.7 MTT吸光度法與平板計數(shù)法的相關性

把培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌懸液進行倍比稀釋為11個濃度梯度.以0.1 mL/孔均勻涂布接種于96 孔板中，以上述MTT法最適反應條件測各孔吸光度值.同時以0.1 mL/皿均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)各皿菌落數(shù)，建立菌液吸光度值與活菌數(shù)目的關系曲線.

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 吸光度范圍的確定

將培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌懸液接種于96 孔板，進行倍比稀釋后，測定OD595，結果見圖1a.將與其平行的另一塊板加入MTT作用3 h后測定OD值(λ=570 nm，下同)，結果見圖1b. 由圖1可知，金黃色葡萄球菌懸液吸光度值隨著稀釋倍數(shù)的增加而逐漸下降.以濁度初步估計細菌的數(shù)量是可行的，但由于濁度值之間的差異很少，很容易受到其它因素的影響而干擾其結果準確性(圖1a).用MTT 法檢測細菌數(shù)量或活力時，當OD570在0.3～1.7時，隨著稀釋倍數(shù)的增加而呈線性下降趨勢(圖1b)，在此范圍內OD570值與細菌數(shù)量呈正比. 為確保各次實驗結果的穩(wěn)定性，實驗中所用菌液均調整濁度至OD595值在0.27±0.03范圍內.

圖1 不同稀釋倍數(shù)對吸光度值的影響Fig.1 The effect of different dilution ratio on the absorbance value

2.2 DMSO用量對吸光度值的影響

將菌懸液接種于96 孔板中并加入MTT 作用3 h后，加入不同量的DMSO 溶解，測得的吸光度值呈現(xiàn)出一定的變化趨勢，結果見圖2.如圖2所示，隨DMSO用量的增加，吸光度值呈上升趨勢，當DMSO用量達菌液體積的2～2.5倍時基本達到峰值.考慮到96孔板每孔的容積，故本實驗條件下確定DMSO 的最佳劑量為200 μL，即菌液體積的2倍.在此范圍內，培養(yǎng)基、菌懸液、菌懸液+MTT、菌懸液+不同劑量的DMSO 所測吸光度值均約為0.2，對MTT法實驗基本無影響.故后續(xù)實驗均以菌懸液+ DMSO為對照.

V/μL圖2 不同體積的DMSO 對吸光度值的影響Fig.2 The effect of volumn of DMSO to the absorbance value

2.3 MTT 作用時間對吸光度值的影響

將菌懸液接種于96孔板中，加入MTT 溶液作用0.5～4 h后加入2倍體積的DMSO，于570 nm下測其吸光度.測得的吸光度呈現(xiàn)出一定的變化趨勢，結果如圖3所示.當作用時間達2 h時吸光度值可達到峰值，故MTT最適作用時間為2 h.

t/h圖3 MTT 作用時間對吸光度的影響Fig.3 The effect of MTT reaction time to the absorbance value

2.4 MTT 濃度對吸光度值的影響

將菌懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的MTT 溶液，作用2 h 后加入2倍體積的DMSO，其吸光度值呈現(xiàn)典型的“鐘型”變化趨勢，結果見圖4.由圖4可見，當MTT作用濃度為0.15～0.25 mg/mL時吸光度值達到峰值.為保證MTT的量足夠與菌液中琥珀酸脫氫酶反應，且在MTT 量充足的情況

下盡量降低MTT 毒性，在本實驗條件中MTT的最適終濃度為0.25 mg/mL.

ρ/(mg·mL-1)圖4 MTT濃度量對吸光度值的影響Fig.4 Effects of the MTT concentration to the absorbance value

2.5 MTT吸光度法與平板菌落計數(shù)法的相關性

將MTT法所測的吸光度值與相對應的活菌數(shù)目之間建立線性關系曲線，結果如圖5所示，活菌數(shù)目(菌落數(shù))在一定范圍內與菌懸液的MTT吸光度值成線性相關，R2=0.9966,y=1008.9x-22.327.

D(λ) 圖5 吸光度值與平板菌落數(shù)目的關系Fig.5 The relationship between the absorbance value and the tablet colony numbers

3 討論

MTT能被活細胞線粒體中脫氫酶還原成藍細胞活性狀態(tài)色Formazan 顆粒，顆粒形成量與活細胞數(shù)量成正比.細菌個體很小，通常在培養(yǎng)基中呈混懸狀生長，低速離心很難將其從培養(yǎng)基中完全分離.而Formazan顆粒需要有機溶劑溶解，這可能是MTT法在細菌中很少使用的原因之一.

本文首先探討了在不去除上清的情況下，DMSO 對金黃色葡萄球菌細菌中Formazan顆粒的溶解情況，當DMSO用量低于2倍菌液體積時，F(xiàn)ormazan顆粒不能完全溶解，吸光度值隨DMSO用量的增加而升高；而當DMSO用量高于2.5倍菌液體積時，吸光度值則不再升高，說明Formazan顆粒

已完全溶解.因此，2～2.5倍菌液體積的DMSO為最適的溶解Formazan顆粒的實驗條件.當MTT作用時間達到并超過2 h后，其吸光度值即可達到峰值，這與細胞需要作用3～4 h不同，可能與兩者脫氫酶存在的部位不同及代謝活性有關.

MTT對活的細菌具有毒性，當MTT的終濃度小于0.15 mg/mL時，隨著MTT用量的增加吸光度值不斷增大；在0.15～0.25 mg/mL時，吸光度值維持在較高水平；但MTT濃度繼續(xù)增大則吸光度值呈持續(xù)下降，說明高濃度的MTT導致細菌活力下降甚至死亡.這可能是因為大量形成的Formazan顆粒結晶對細菌形成機械損傷甚至破裂死亡.以有足量甚至過量的MTT與菌液中琥珀酸脫氫酶反應，本實驗確定最適MTT濃度為0.25 mg/mL.

當細菌數(shù)在105～107個/mL時，MTT法所測的吸光度值與平板法所測的細菌活菌數(shù)量呈線性相關，R2>0.99，說明MTT法在一定范圍內可準確反映活菌數(shù)量.

參 考 文 獻

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