崔 亮,張薇婷,林 暉,朱 志,楊朝勇

(廈門大學 化學化工學院,固體表面物理化學國家重點實驗室,譜學分析與儀器教育部重點實驗室,福建 廈門 361005)

石墨烯(graphene)是由碳原子以sp2雜化軌道形成六角型蜂巢晶格的平面薄膜[1-2],得益于石墨烯獨特的物理、化學及結(jié)構(gòu)性能,石墨烯及其衍生物已被廣泛應用于各種領域,包括電子學、材料科學、能源技術(shù)、催化科學等[3-5]．作為石墨烯的一種衍生物,氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是通過對石墨烯氧化加工而成,具有水溶性好、表面易于修飾等特性,因而在生物分析領域得到了廣泛的應用[6],其中一個代表性應用就是利用核酸分子探針與GO的相互作用實現(xiàn)一系列生物分析．自2009年,第一篇報道關于DNA分子探針結(jié)合GO用于高靈敏檢測DNA和蛋白質(zhì)[7]以來,GO已經(jīng)發(fā)展為一個通用分析平臺用于核酸、蛋白質(zhì)、核酸酶、小分子及金屬離子的檢測[8-10]．除此之外,核酸與GO相互作用帶來的新的效應,如吸附于GO表面的核酸能夠抵抗核酸酶的降解,也被證明并得到了新的應用[11]．在本文里,我們綜述了科學家們對GO保護核酸抵抗核酸酶降解的研究及在此研究基礎上展開的一系列應用[12]．

1 GO對核酸的吸附、保護性能及機理探討

圖1 熒光標記的ssDNA用于核酸(A)[7]、蛋白質(zhì)(B)[13]及小分子(C)[14]的檢測原理Fig.1 Fluorophore-labeled ssDNA probes for detection of nucleic acid (A)[7],protein (B)[13] and small molecule (C)[14]

2009年,Yang等[7]報道了熒光標記的單鏈DNA(single strand DNA,ssDNA)探針能夠吸附于GO表面,同時熒光信號被淬滅;當與ssDNA完全互補的目標DNA(complementary DNA,cDNA)出現(xiàn)以后,2條鏈互補結(jié)合形成剛性的雙鏈結(jié)構(gòu)，能夠脫離GO表面,被淬滅的熒光信號得到恢復,從而實現(xiàn)對目標DNA的檢測(圖1(A))．除此以外,當核酸適體(aptamer)與相對應的目標物如蛋白質(zhì)(圖1(B))[13]、小分子(圖1(C))[14]結(jié)合以后,單鏈的核酸適體形成了穩(wěn)定的二級或三級結(jié)構(gòu),同樣能夠脫離GO表面,從而利用單熒光標記的核酸適體探針對相對應的目標物進行檢測．Fan等[15]研究了GO對ssDNA的吸附作用機理,他們使用分子動力學(molecular dynamics,MD)模擬研究了ssDNA及雙鏈DNA(double strand DNA,dsDNA)在GO表面的作用圖譜．通過π-π共價鍵堆積反應,ssDNA上的核苷酸堿基環(huán)能夠與GO表面的六邊形晶胞產(chǎn)生緊密結(jié)合,介導ssDNA穩(wěn)定地吸附于GO表面．而cDNA的出現(xiàn)使其形成雙鏈,堿基之間氫鍵相互作用使dsDNA無法再與GO作用,造成dsDNA脫離．

基于ssDNA能夠穩(wěn)定地吸附于GO表面,而dsDNA或者形成了穩(wěn)定二級/三級結(jié)構(gòu)的ssDNA能夠脫離GO的性質(zhì),人們開發(fā)了各種基于GO平臺的化學/生物學傳感器用于分析檢測,這在許多綜述性文章中已有報道[16-22]．

ssDNA吸附于GO也帶來了其他的生物學效應．2010年,Tang等[11]使用電泳、熒光偏振等方式研究了當ssDNA吸附于GO表面以后,核酸酶對DNA的水解能力．如圖2(A)所示,自由的ssDNA與DNase I孵育20 min后,部分被水解(lane 2),60 min后,全部被降解(lane 3)．然而,當ssDNA吸附于GO表面以后,即使經(jīng)過了60 min的DNase I消化,DNA仍然沒有發(fā)生任何變化．熒光偏振實驗同樣證明了該現(xiàn)象,熒光標記的ssDNA在與DNase I作用以后,偏振信號逐漸降低,表明由于ssDNA被水解,熒光分子的偏振信號發(fā)生了改變．而當熒光標記的ssDNA吸附于GO表面以后,加入DNase I,偏振信號沒有發(fā)生任何改變,表明ssDNA分子仍然完整地存在．以上結(jié)果均表明,ssDNA吸附于GO表面后,能夠被GO保護抵抗核酸酶的降解．

(A)ssDNA以及ssDNA/GO復合物與DNase I的凝膠 電泳結(jié)果[11].1.ssDNA，2.ssDNA與DNase I反應20 min， 3.ssDNA與DNase I反應60 min，4.ssDNA/GO復合物， 5.ssDNA/GO與DNase I反應20 min，6.ssDNA/GO與 DNase I反應60 min；(B)凝膠電泳分析probe-GO復合物 (左)以及probe/RNA-GO復合物(右)與DNase I 的作用結(jié)果[23];(C) rMB和rMB-GO在cryonase存在下的 實時熒光掃描及電泳結(jié)果圖(插圖)[25]．圖2 ssDNA、RNA及二者的GO 復合物與核酸酶的相互作用Fig.2 Interation between nuclease and ssDNA, RNA,ssDNA/GO and RNA/GO complexes

在此基礎上,我們實驗室研究了當吸附于GO表面的ssDNA形成雙鏈脫離GO以后與DNase I的作用效果[23]．如圖2(B)所示,ssDNA吸附于GO表面后,加入DNase I孵育60 min,ssDNA未被降解,這與前面的研究結(jié)果是一致的[11]．當加入與其互補的RNA以后,再與DNase I孵育60 min,由于DNase I只能作用于DNA而對RNA沒有降解效果,互補的RNA保持完整狀態(tài),而ssDNA完全被降解(其中藍色條帶為DNA,紫色條帶為RNA)．該結(jié)果表明,當吸附于GO表面的ssDNA脫離GO表面以后,由于不再受GO的保護,因此能夠被核酸酶降解．

以上的結(jié)果同樣表明,GO保護DNA不受核酸酶降解的性質(zhì)僅與DNA是否吸附于GO表面相關．當存在足夠的鹽離子,dsDNA同樣能夠吸附于GO表面,因此能夠抵抗核酸酶的降解[24]．

GO除了能夠保護DNA不受核酸酶降解以外,同樣能夠?qū)NA產(chǎn)生保護能力．我們實驗室系統(tǒng)地研究了吸附于GO表面的RNA的抗酶切效果[25]．我們使用RNA 分子信標(RNA molecular beacon,rMB)作為研究對象,使用cryonase核酸酶(該酶能夠降解一切類型的核酸)作為工具酶．如圖2(C)所示,無論熒光還是電泳實驗(圖2(C)插圖),自由的rMB在與cryonase核酸酶作用后短短的時間里即被水解,而當吸附于GO表面后,與cryonase核酸酶長時間作用仍然無任何變化,表明GO能夠保護吸附于其表面的RNA不被降解．

到目前為止,愈來愈多的研究報道了金納米顆粒、硅納米顆粒、碳納米管以及GO等納米材料對核酸的保護能力,并對其保護機理進行了探討[26-30]．我們在此處總結(jié)了幾種具有說服力的保護機理[31]．

首先,在解釋金納米顆粒和硅納米顆粒對DNA的保護能力時,有人認為這些納米材料能夠誘導其表面產(chǎn)生一個不利于核酸酶發(fā)揮活性的鹽離子環(huán)境,從而導致核酸酶無法對吸附于納米材料表面/周圍的核酸發(fā)揮作用[26,28,30]．其次,另一個觀點則認為納米材料改變了吸附于其表面的核酸的構(gòu)象,從而導致核酸酶無法識別[29,32]．目前廣為接受的一個理論是“位阻效應(steric hindrance)”[11,24,30,33]．該理論認為,納米材料和核酸酶同是納米尺寸,因此,核酸酶無法攻擊納米材料表面的“小分子”核酸[25]．

這些觀點在解釋一些特定的現(xiàn)象時看似完美,但新的實驗現(xiàn)象往往不斷挑戰(zhàn)著這些理論．比如,“位阻效應”理論認為核酸酶無法攻擊吸附于納米材料表面的DNA,但在2011年,Mirkin等[34]報道了DNA修飾的金納米顆粒顯著地增加了RNase H對RNA的降解能力,該現(xiàn)象與“位阻效應”背道而馳．2012年,Li等[32]報道在一定條件下,dsDNA也能夠吸附于GO表面,并且仍然能夠被DNase I和EcoR I攻擊．但是根據(jù)位阻效應,吸附于GO表面的dsDNA能夠抵抗核酸酶的攻擊,這也有悖于位阻效應．因此,納米材料保護核酸的機理,仍然存在許多未知,有待于科學家們進一步發(fā)掘．

盡管GO對核酸的保護機理仍然有待研究確認,其對核酸的保護能力卻是毋庸置疑的．與其他納米材料無異,GO對核酸的良好保護效果一經(jīng)發(fā)現(xiàn),便被廣泛應用于體內(nèi)生物成像、生物醫(yī)學等領域．與此同時,在體外分析中GO-核酸體系一方面可用于構(gòu)建穩(wěn)定的RNA探針用于生物分析,另一方面,建立起全新的分析平臺——循環(huán)酶切信號放大方法(cyclic enzymatic amplification method,CEAM)檢測分析物,能夠顯著提高待測物的檢測靈敏度．在接下來的章節(jié)中,我們將分別討論GO保護的核酸分子探針在生物分析領域的各種應用．

2 GO提高RNA分子探針的穩(wěn)定性

核酸分子探針,包括DNA和RNA分子探針．目前,DNA分子探針已被深入研究和廣泛報道,而RNA分子探針的研究工作卻相對較少．造成這種現(xiàn)象的主要原因是:RNA具有相對活躍的化學反應基團[35],同時,環(huán)境中無處不在的核糖核酸酶,致使RNA容易被降解,最終易導致高背景以及假陽性信號[36]．因此,為使RNA分子探針得到廣泛應用,我們首要發(fā)展穩(wěn)定RNA的方法[31]．

圖3 GO保護RNA探針的原理(A)及rMB、GO-rMB的熒光光譜圖(B)和信背比(C)[25]Fig.3 Principle of protection of RNA probe with GO(A), fluorescence spectra (B) and signal-background ratio (C) of rMB and GO-rMB[25]

基于GO對核酸分子的保護效果,我們實驗室提出了使用GO穩(wěn)定RNA探針的方法[25]．其原理如圖3(A)所示,沒有GO保護的RNA分子探針,如rMB,在實驗室環(huán)境下易被降解,因此容易產(chǎn)生假陽性信號．在GO的保護下,rMB只能夠?qū)μ禺惖哪繕宋镯憫?不會產(chǎn)生高背景和假陽性信號,從而有效地檢測目標物．我們的方案得到了實驗數(shù)據(jù)的驗證,如圖3(B)所示,對于自由的rMB,放置于實驗室環(huán)境下,熒光信號逐日上升,表明rMB在實驗室環(huán)境極易被降解,到達15 d后,信號趨于飽和,表明rMB已經(jīng)完全被降解．相對應的,對于GO保護的rMB,經(jīng)過15 d的實驗室環(huán)境放置,信號沒有發(fā)生變化．在此基礎上通過考察與cDNA雜交后的信背比(S/B)比較了2種rMB的工作能力,如圖3(C)所示,對于未被保護的rMB,第5天信背比已經(jīng)下降至1.68,而GO保護的rMB到達第15天后,其信背比仍能保持在7.5左右,充分說明RNA分子探針在GO的保護下能夠穩(wěn)定工作．

圖4 RNA-GO納米片用于分離和富集肽毒素的方案[38]Fig.4 Schematic fabrication process of RNA-graphene oxide nanosheets[38]

借助RNase H能夠特異性水解與DNA雜交的RNA,而對單獨的DNA或RNA無作用效果,Corn等基于RNA微陣列發(fā)展了用于高靈敏的RNase H輔助的信號放大方法、用于檢測基因組DNA的SPR成像技術(shù),然而,由于RNA探針極不穩(wěn)定,他們最終拋棄了這種方法[37]．借助于GO的保護能力,我們重新發(fā)展了RNase H輔助的信號放大方法用于檢測DNA,該方法實現(xiàn)了0.1 pmol/L DNA檢測,并具有區(qū)分單堿基錯配識別的能力,更重要的是,由于GO的保護,我們的方法能夠使RNA探針穩(wěn)定存在,避免了復雜的操作,從而發(fā)展了操作簡單、靈敏度高的DNA檢測方法[25]．

我們同時發(fā)展了GO保護的RNA核酸分子探針用于生物分析．設計了GO保護的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和茶堿的RNA核酸適體分子探針，分別用于VEGF和茶堿的高靈敏檢測,分別實現(xiàn)了2 nmol/L VEGF和2 μmol/L茶堿的靈敏檢測．這些方法避免了對RNA繁瑣而復雜的操作[25]．

GO保護的RNA分子探針除了用于分析物的檢測,Zhou等[38]也將其用于富集并捕獲飲用水中痕量存在的肽毒素(peptide toxins)．如圖4所示，他們將肽毒素的RNA核酸適體通過化學交聯(lián)的方式固定于GO表面,在遇到肽毒素以后,RNA核酸適體識別并與其結(jié)合,導致大量的肽毒素富集于GO表面,起到富集捕獲的效果．通過調(diào)節(jié)pH及溫度,捕獲的肽毒素被釋放,使得該GO保護的RNA分子探針能夠循環(huán)使用．該方法設計簡單、制作方便、特異性高,有望在水污染純化及復雜體系中的樣品制備等領域得到廣泛應用．

3 基于GO的CEAM

GO對核酸的保護能力除了應用于在實驗室環(huán)境下穩(wěn)定RNA探針的存在,還能夠與特異的核酸酶結(jié)合,發(fā)展高靈敏高選擇性的放大化分析方法用于提高檢測物的靈敏度．

如前所述,熒光標記的ssDNA探針能夠吸附于GO表面,目標DNA或其他目標分子與其結(jié)合形成雙鏈或具有穩(wěn)定二級/三級結(jié)構(gòu)的DNA能夠脫離GO,熒光信號恢復,從而實現(xiàn)對目標物的檢測．然而,在這一類檢測方式中,一個目標物只能觸發(fā)一個分子探針信號的打開,這種1∶1的檢測方案限制靈敏度的進一步提高．當研究者們發(fā)現(xiàn)GO能夠有效地保護ssDNA不受核酸酶降解以后,便發(fā)展了CEAM[39-41],實現(xiàn)了一個目標物分子觸發(fā)多個核酸分子探針信號打開,將對目標物的檢測靈敏度提高了2～3個數(shù)量級．

我們實驗室將該CEAM方法用于MicroRNA(miRNA)的檢測[23]．miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,其表達水平與人類許多疾病密切相關,這使miRNA成為新的生物標志物,在癌癥等重大疾病的早期診斷中意義重大[42-43]．因此,miRNA的定量檢測和表達分析是十分重要的[44]．基于DNase I對DNA的特異性水解性能,我們實現(xiàn)了放大化高靈敏的miRNA檢測[23]．其原理如圖5(A)所示,將與miRNA互補的DNA熒光探針與GO孵育,此時探針的熒光被淬滅并能夠抵抗DNase I的降解．目標miRNA出現(xiàn)后與DNA探針形成了miRNA/DNA雙鏈復合物脫離GO表面,發(fā)出熒光信號．同時,脫離了GO表面的DNA探針不再被GO保護,成為DNase I的水解底物．由于DNase I無法水解miRNA,miRNA釋放并與下一條DNA探針雜交,再形成雙鏈脫離GO表面,構(gòu)成水解—雜交—脫附—水解的CEAM過程．同時,針對不同的miRNA設計不同熒光標記的熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)對miRNA的多目標檢測[31]．

圖5 GO保護的ssDNA探針用于miRNA的高靈敏分析[23]Fig.5 Analysis of miRNA based on GO-protected ssDNA probes[23]

圖5(B)證明了該方法的信號放大效果．對于GO/探針體系,加入0.1 nmol/L的miRNA,由于在1∶1的檢測方案下,此濃度的miRNA觸發(fā)的熒光信號無法達到儀器能夠識別的級別,因此從儀器上觀察到的熒光信號沒有任何變化．此時加入DNase I,熒光信號在20 min內(nèi)上升了4倍,說明DNase I輔助的循環(huán)酶切放大成功發(fā)生,證明了該方法的可行性．使用該方法,我們實現(xiàn)了9 pmol/L的miRNA檢測靈敏度(圖5(C)),與常規(guī)的方法相比,靈敏度提高了3個數(shù)量級．同時,該方法能夠較好地區(qū)分序列高度相似的let 7家族的幾種miRNA(他們之間只有一個或幾個堿基之間的差別)．另外,借助于GO對核酸探針的保護效果,我們的方法能夠直接用于復雜的生物體系如細胞裂解液中miRNA檢測,并能夠區(qū)分不同細胞系之間miRNA的表達水平[12]．

Yang等設計了用于三磷酸腺苷(ATP)、可卡因等小分子的高靈敏檢測CEAM[14]．以檢測ATP為例,羧基熒光素(FAM)標記的ATP核酸適體探針吸附于GO表面,熒光信號被淬滅,同時DNase I無法將其降解．ATP出現(xiàn)后,與其核酸適體結(jié)合形成復合物,脫離GO表面,發(fā)出熒光信號．同時,脫離了GO表面的ATP核酸適體分子探針不再受GO保護,成為DNase I的水解底物,從而導致探針被水解,并將ATP釋放,釋放的ATP重新與另一條核酸適體探針結(jié)合,實現(xiàn)解吸附-被水解-釋放ATP的循環(huán)過程,最終實現(xiàn)了一個ATP分子持續(xù)觸發(fā)多個核酸分子探針釋放出熒光信號的過程,從而能夠提高對ATP的檢測靈敏度．通過這種方式,實現(xiàn)40 nmol/L的ATP檢測,相對于1∶1的檢測方案(檢測限:10 μmol/L),靈敏度提高了200倍．該作者同時將該方法用于可卡因的檢測,實現(xiàn)了50 nmol/L的檢測靈敏度．

基于同樣的原理,Tan等[45]發(fā)展了胰島素的高靈敏檢測方法,他們實現(xiàn)了5 nmol/L的胰島素檢測,該方法的建立將有利于發(fā)展糖尿病早期診斷的方法．

除建立熒光檢測的CEAM方法,CEAM也被拓展到電化學領域．Chen等[46]建立了磁控的GO傳感平臺用于放大化、多目標、電化學檢測ATP和可卡因,分別實現(xiàn)了0.1和1.5 pmol/L的檢測靈敏度．

4 以GO為載體的細胞內(nèi)檢測與成像方法

近年來,功能化核酸(functional nucleic acids,FNAs)憑借其獨特的優(yōu)勢,在生物分析及生物醫(yī)學領域得到廣泛的應用,包括靶向藥物運輸、基因調(diào)控、體內(nèi)檢測與成像等[47-51]．然而,作為一種帶負電的生物大分子,FNAs需要通過載體將其帶入細胞或體內(nèi)[28,52];另外,由于細胞內(nèi)存在各種各樣的核酸酶,外源FNAs極易受到降解,因此需要能夠穩(wěn)定/保護FNAs存在的載體或方法[53-54]．因此,高效、無毒并能夠穩(wěn)定FNAs的運輸載體是必不可少的[28]．GO作為一種獨特的碳納米材料,細胞毒性低、能夠有效地進入細胞[55-56],更重要的是,能夠吸附核酸并保護其不受核酸酶的降解,從而被作為運輸載體而廣泛應用于細胞及活體內(nèi)分析．

Lin等[57]將單熒光標記的ATP核酸適體探針與GO共同孵育,探針吸附于GO表面導致熒光淬滅,將此探針/GO復合物用于檢測老鼠上皮細胞內(nèi)的ATP．借助于GO對探針的保護效果,以及GO能夠自由進入細胞等優(yōu)點,該方法成功實現(xiàn)了細胞內(nèi)ATP的成像檢測．在此基礎上,為了實現(xiàn)對細胞內(nèi)不同核苷酸的同時/多目標檢測,他們分別設計了FAM標記的ATP核酸適體,Cy5標記的GTP核酸適體,以及Alex546N標記的隨機序列,并將他們與GO共同孵育,利用GO對熒光光譜的廣譜淬滅效果,所有的熒光探針熒光均被淬滅．當與細胞共同孵育以后,2種核酸適體與其對應的目標物結(jié)合,能夠發(fā)出不同的熒光信號,從而實現(xiàn)對細胞內(nèi)核苷酸的多目標檢測(圖6)[58]．

圖6 GO作為載體用于細胞內(nèi)核苷酸的 多目標檢測方案(A)和效果(B)[58]Fig.6 Scheme (A) and performance (B) of GO delivery of multiplex aptasensors for intracellular nucleotides detection[58]

與此類似,Yang等[59]使用GO作為載體將分子信標載入HeLa細胞內(nèi)用于生存素(survivin)mRNA的檢測．他們分別設計了生存素mRNA的分子信標及隨機序列分子信標,并將其分別與GO孵育,考察了GO存在和不存在的情況下,生存素mRNA的分子信標及隨機序列的分子信標與HeLa細胞相互作用的效果．結(jié)果表明,吸附于GO表面的生存素mRNA的分子信標能夠在GO的載體作用下進入細胞,并在遇到生存素mRNA后打開,在熒光顯微鏡下觀察到熒光信號．作為對照,自由的生存素mRNA分子信標以及吸附于GO表面的隨機序列分子信標在與HeLa作用以后,沒有可觀察到的熒光信號．該結(jié)果表明,GO能夠作為載體將分子信標帶入到細胞內(nèi)用于檢測目標mRNA．

隨著GO被廣泛應用的同時,其不足之處也逐漸暴露,其中之一是其尺寸的不均一性．單原子排列的GO在其二維平面上的隨機擴展,長度能夠從納米級別延伸到微米級別．這種尺寸的不均一性造成其氧化程度不均一、實驗重復性差以及進入細胞困難等諸多問題[60]．為此,科學家們發(fā)展了一系列納米尺寸的GO(nanoscale graphene oxide,nGO;graphene oxide quantum dots),并將其應用于體內(nèi)/體外的生物傳感、生物醫(yī)學等領域．

圖7 納米尺寸的GO用于細胞內(nèi)mRNA(A)[61]及miRNA(B)[62]的成像分析Fig.7 Scheme of strategy for mRNA(A)[61]/miRNA(B)[62] sensor based on nGO

Seo等[61]設計了球形的graphite nanoparticle (GN) 交聯(lián)的分子信標用于細胞內(nèi)基因檢測．這種GN尺寸均一(4～5 nm),當分子信標與其交聯(lián)以后,能夠保護MB不受核酸酶降解,同時,由于其具有較小的尺寸和較好的進入細胞的能力,而被設計為用于細胞內(nèi)特定基因檢測的工具(圖7(A))．

肽核酸是一種以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物,與天然核酸相比,肽核酸呈電中性;同時,肽核酸與天然核酸雜交形成的雙鏈穩(wěn)定性要高于天然的核酸雙鏈．基于這些特性,科學家們研究了熒光標記的肽核酸探針與nGO結(jié)合用于體外及體內(nèi)分析物的傳感．一方面,電中性的肽核酸與nGO具有更強的結(jié)合力,因此降低了背景信號;另一方面,肽核酸探針與cDNA/cRNA的結(jié)合具有更強的穩(wěn)定性,從而能夠擺脫nGO的吸附,提高了檢測信號．他們將肽核酸探針/nGO用于miRNA檢測,在1∶1的檢測方案下實現(xiàn)了1 pmol/L的檢測靈敏度．在此基礎上,實現(xiàn)了細胞內(nèi)miRNA的定量檢測(圖7(B))[62]．

上述研究,以GO/nGO為載體,有效地實現(xiàn)了細胞內(nèi)mRNA、miRNA、ATP、GTP等重要生物分子的成像檢測．同時,也證明了作為一種新材料,GO:1) 能夠作為載體有效地運輸FNAs進入細胞;2) 能夠保護FNAs不受細胞內(nèi)核酸酶的降解,因此能夠使其穩(wěn)定存在;3) 能夠與FNAs形成復合物構(gòu)建傳感平臺,用于細胞成像．

5 結(jié)論和展望

自2004年第一次報道以來,石墨烯和GO就以其突出的物理/化學性質(zhì)而被應用于各種領域[1,63]．近年來,GO對核酸的結(jié)合能力以及由此帶來的抗酶切效果,吸引了科學家們的廣泛關注并展開了新的應用．一方面,GO能夠保護RNA探針分子不受環(huán)境中核酸酶的攻擊,從而發(fā)展了穩(wěn)定RNA存在的方法用于特定目標物的檢測、富集及分離;另一方面,GO對ssDNA的吸附及dsDNA的脫吸附,導致相應的保護/去保護效果,激發(fā)了科學家們發(fā)展CEAM用于目標分析物的高靈敏檢測．相對于常規(guī)的1∶1檢測方案,CEAM實現(xiàn)了2～3個數(shù)量級靈敏度的提高．在體內(nèi),GO對核酸的保護效果,以及GO本身自由進入細胞的能力、體內(nèi)無毒性等優(yōu)點使其能夠成為優(yōu)秀的“共靶向”分子,用于細胞內(nèi)檢測和成像等[12]．

目前,對GO保護核酸的研究及應用仍然有待深入．一方面,GO能夠保護核酸抵抗核酸酶降解的機理仍然有待探討,新的理論和假說需要提出[31]．另一方面,GO保護核酸的應用仍然處于概念論證(proof-of-concept)階段．為了能夠使該研究真正應用于實際檢測或臨床體系,需要驗證更多的目標物以及更復雜的生物體系．最后,除GO相關的研究之外,本文也提到了其他納米材料與功能核酸之間的相互作用及由此帶來的應用．眾所周知,近年來新的納米材料層出不窮,如碳納米顆粒[64]、C60[65]、上轉(zhuǎn)換納米顆粒及其他納米材料[66-67],這些新的納米材料與核酸又具有怎樣的相互作用關系、這些納米材料本身又具有什么樣的獨特的性能,這部分研究工作將是引人入勝又充滿挑戰(zhàn),而納米材料與功能化核酸的結(jié)合將對分子生物學、生物化學、分子醫(yī)學等領域產(chǎn)生新的進步性影響．

[1] Novoselov K S,Geim A K,Morozov S V,et al.Electric field effect in atomically thin carbon films[J].Science,2004,306 (5696)：666-669.

[2] Geim A K,Novoselov K S,The rise of graphene[J].Nature Materials,2007,6(3)：183-191.

[3] Rao C N,Sood A K,Subrahmanyam K S,et al.Graphene:the new two-dimensional nanomaterial[J].Angew Chem Int Ed,2009,48(42)：7752-7777.

[4] Yang W,Ratinac K R,Ringer S P,et al.Carbon nanomaterials in biosensors:should you use nanotubes or graphene?[J].Angew Chem Int Ed,2010,49 (12)：2114-2138.

[5] Shen H,Zhang L,Liu M,et al.Biomedical applications of graphene[J].Theranostics,2012,2(3)：283-294.

[6] Guo S,Dong S,Graphene nanosheet:synthesis,molecular engineering,thin film,hybrids,and energy and analytical applications[J].Chemical Society Reviews,2011,40(5)：2644-2672.

[7] Lu C H,Yang H H,Zhu C L,et al.A graphene platform for sensing biomolecules[J].Angew Chem Int Ed,2009,48(26)：4785-4787.

[8] Loh K P,Bao Q L,Eda G,et al.Graphene oxide as a chemically tunable platform for optical applications[J].Nature Chemistry,2010,2(12)：1015-1024.

[9] Liu Y,Dong X,Chen P.Biological and chemical sensors based on graphene materials[J].Chemical Society Reviews,2012,41(6)：2283-2307.

[10] Morales-Narvaez E,Merkoci A.Graphene oxide as an optical biosensing platform[J].Advanced Materials,2012,24(25):3298-3308.

[11] Tang Z,Wu H,Cort J R,et al.Constraint of DNA on functionalized graphene improves its biostability and specificity[J].Small,2010,6 (11):1205-1209.

[12] Cui L,Song Y,Ke G.et al.Graphene oxide protected nucleic acid probes for bioanalysis and biomedicine[J].Chemistry-A European Journal,2013,19(32):10442-10451.

[13] Chang H X,Tang L H,Wang Y,et al.Graphene fluorescence resonance energy transfer aptasensor for the thrombin detection[J].Analytical Chemistry,2010,82(6):2341-2346.

[14] Lu C H,Li J,Lin M H,et al.Amplified aptamer-based assay through catalytic recycling of the analyte[J].Angew Chem Int Ed,2010,49 (45):8454-8457.

[15] He S J,Song B,Li D,et al.A graphene nanoprobe for rapid,sensitive,and multicolor fluorescent DNA analysis[J].Advanced Functional Materials,2010,20(3):453-459.

[16] Stankovich S,Dikin D A,Dommett G H,et al.Graphene-based composite materials[J].Nature,2006,442 (7100):282-286.

[17] Li F,Huang Y,Yang Q,et al.A graphene-enhanced molecular beacon for homogeneous DNA detection[J].Nanoscale,2010,2 (6):1021-1026.

[18] Lu C H,Li J,Liu J J,et al.Increasing the sensitivity and single-base mismatch selectivity of the molecular beacon using graphene oxide as the "nanoquencher"[J].Chemistry-A European Journal,2010,16(16):4889-4894.

[19] Somers R C,Bawendi M G,Nocera D G.CdSe nanocrystal based chem-/bio-sensors[J].Chemical Society Reviews,2007,36(4):579-591.

[20] Chung C,Kim Y K,Shin D,et al.Biomedical applications of graphene and graphene oxide[J].Accounts of Chemical Research,2013,46(10):2211-2224.

[21] Chen D,Feng H,Li J.Graphene oxide:preparation,functionalization,and electrochemical applications[J].Chemical Reviews,2012,112(11):6027-6053.

[22] Wang Y,Li Z,Wang J,et al.Graphene and graphene oxide:biofunctionalization and applications in biotechnology[J].Trends in Biotechnology,2011,29(5):205-212.

[23] Cui L,Lin X,Lin N,et al.Graphene oxide-protected DNA probes for multiplex microRNA analysis in complex biological samples based on a cyclic enzymatic amplification method[J].Chemical Communications,2012,48(2):194-196.

[24] Lei H,Mi L,Zhou X,et al.Adsorption of double-stranded DNA to graphene oxide preventing enzymatic digestion[J].Nanoscale,2011,3(9):3888-3892.

[25] Cui L,Chen Z,Zhu Z,et al.Stabilization of ssRNA on graphene oxide surface:an effective way to design highly robust RNA probes[J].Analytical Chemistry,2013,85(4):2269-2275.

[26] He X X,Wang K,Tan W,et al.Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage[J].J Am Chem Soc,2003,125(24):7168-7169.

[27] Chen C C,Liu Y C,Wu C H,et al.Preparation of fluorescent silica nanotubes and their application in gene delivery[J].Advanced Materials,2005,17(4):404-407.

[28] Giljohann D A,Seferos D S,Daniel W L,et al.Gold nanoparticles for biology and medicine[J].Angew Chem Int Ed,2010,49(19):3280-3294.

[29] Wu Y,Phillips J A,Liu H,et al.Carbon nanotubes protect DNA strands during cellular delivery[J].ACS Nano,2008,2(10):2023-2028.

[30] Seferos D S,Prigodich A E,Giljohann D A,et al.Polyvalent DNA nanoparticle conjugates stabilize nucleic acids[J].Nano Letters,2009,9 (1):308-311.

[31] 崔亮.核酸分子探針信號放大新策略及其在生物分析中的應用[D].廈門:廈門大學,2013.

[32] Tang L,Chang H,Liu Y,et al.Duplex DNA/graphene oxide biointerface:from fundamental understanding to specific enzymatic effects[J].Advanced Functional Materials,2012,22(14):3083-3088.

[33] Nielsen L J,Olsen L F,Ozalp V C.Aptamers embedded in polyacrylamide nanoparticles:a tool for in vivo metabolite sensing[J].ACS Nano,2010,4 (8):4361-4370.

[34] Prigodich A E,Alhasan A H,Mirkin C A.Selective enhancement of nucleases by polyvalent DNA-functionalized gold nanoparticles[J].J Am Chem Soc,2011,133 (7):2120-2123.

[35] Oivanen M,Kuusela S,Lonnberg H.Kinetics and mechanisms for the cleavage and isomerization of the phosphodiester bonds of RNA by bronsted acids and bases[J].Chemical Reviews,1998,98(3):961-990.

[36] Carrasquilla C,Lau P S,Li Y,et al.Stabilizing structure-switching signaling RNA aptamers by entrapment in sol-gel derived materials for solid-phase assays[J].J Am Chem Soc,2012,134 (26):10998-11005.

[37] Goodrich T T,Lee H J,Corn R M.Direct detection of genomic DNA by enzymatically amplified SPR imaging measurements of RNA microarrays[J].J Am Chem Soc,2004,126 (13):4086-4087.

[38] Hu X,Mu L,Wen J,et al.Immobilized smart RNA on graphene oxide nanosheets to specifically recognize and adsorb trace peptide toxins in drinking water[J].Journal of Hazardous Materials,2012,213/214:387-392.

[39] Cui L,Ke G,Wang C,et al.A cyclic enzymatic amplification method for sensitive and selective detection of nucleic acids[J].Analyst,2010,135 (8):2069-2073.

[40] Cui L,Ke G,Zhang W Y,et al.A universal platform for sensitive and selective colorimetric DNA detection based on Exo III assisted signal amplification[J].Biosensors and Bioelectronics,2011,26 (5):2796-2800.

[41] Yang C J,Cui L,Huang J,et al.Linear molecular beacons for highly sensitive bioanalysis based on cyclic Exo III enzymatic amplification[J].Biosensors and Bioelectronics,2011,27 (1):119-124.

[42] Farh K K H,Grimson A,Jan C,et al.The widespread impact of mammalian microRNAs on mRNA repression and evolution[J].Science,2005,310 (5755):1817-1821.

[43] Grimson A,Farh K K,Johnston W K,et al.MicroRNA targeting specificity in mammals:determinants beyond seed pairing[J].Molecular Cell,2007,27 (1):91-105.

[44] Cui L,Zhu Z,Lin N,et al.A T7 exonuclease-assisted cyclic enzymatic amplification method coupled with rolling circle amplification:a dual-amplification strategy for sensitive and selective microRNA detection[J].Chemical Communications,2014,50:1576-1578.

[45] Pu Y,Zhu Z,Han D,et al.Insulin-binding aptamer-conjugated graphene oxide for insulin detection[J].Analyst,2011,136 (20):4138-4140.

[46] Tang D,Tang J,Li Q,et al.Ultrasensitive aptamer-based multiplexed electrochemical detection by coupling distinguishable signal tags with catalytic recycling of DNase I[J].Analytical Chemistry,2011,83 (19):7255-7259.

[47] Stein C A,Cheng Y C.Antisense oligonucleotides as therapeutic agents--is the bullet really magical?[J].Science,1993,261(5124):1004-1012.

[48] Wang K M,Tang Z W,Yang C Y J,et al.Molecular engineering of DNA:molecular beacons[J].Angew Chem Int Ed,2009,48 (5):856-870.

[49] Kaur H,Babu B R,Maiti S.Perspectives on chemistry and therapeutic applications of locked nucleic acid (LNA)[J].Chemical Reviews,2007,107 (11):4672-4697.

[50] Seferos D S,Giljohann D A,Hill H D,et al.Nano-flares:probes for transfection and mRNA detection in living cells[J].J Am Chem Soc,2007,129(50):15477-15479.

[51] Cutler J I,Auyeung E,Mirkin C A.Spherical nucleic acids[J].J Am Chem Soc,2012,134(3):1376-1391.

[52] Lebedeva I,Stein C A.Antisense oligonucleotides:promise and reality[J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology,2001,41:403-419.

[53] Uchiyama H,Hirano K,Kashiwasake-Jibu M,et al.Detection of undegraded oligonucleotides in vivo by fluorescence resonance energy transfer.Nuclease activities in living sea urchin eggs[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271 (1):380-384.

[54] Yang C J,Wang L,Wu Y,et al.Synthesis and investigation of deoxyribonucleic acid/locked nucleic acid chimeric molecular beacons[J].Nucleic Acids Research,2007,35 (12):4030-4041.

[55] Jeong H K,Jin M,Ra E J,et al.Enhanced electric double layer capacitance of graphite oxide intercalated by poly(sodium 4-styrensulfonate) with high cycle stability[J].ACS Nano,2010,4 (2):1162-1166.

[56] Liu Z,Robinson J T,Sun X,et al.PEGylated nanographene oxide for delivery of water-insoluble cancer drugs[J].J Am Chem Soc,2008,130 (33):10876-10877.

[57] Wang Y,Li Z,Hu D,et al.Aptamer/graphene oxide nanocomplex for in situ molecular probing in living cells[J].J Am Chem Soc,2010,132 (27):9274-9276.

[58] Wang Y,Li Z,Weber T J,et al.In situ live cell sensing of multiple nucleotides exploiting DNA/RNA aptamers and graphene oxide nanosheets[J].Analytical Chemistry,2013,85 (14):6775-6782.

[59] Lu C H,Zhu C L,Li J,et al.Using graphene to protect DNA from cleavage during cellular delivery[J].Chemical Communications,2010,46 (18):3116-3118.

[60] Chou S S,De M,Luo J Y,et al.Nanoscale graphene oxide (nGO) as artificial receptors:implications for biomolecular interactions and sensing[J].J Am Chem Soc,2012,134(40):16725-16733.

[61] Piao Y X,Liu F,Seo T S.A novel molecular beacon bearing a graphite nanoparticle as a nanoquencher for in situ mRNA detection in cancer cells[J].Acs Applied Materials & Interfaces,2012,4(12):6784-6788.

[62] Ryoo S R,Lee J,Yeo J,et al.Quantitative and multiplexed microRNA sensing in living cells based on peptide nucleic acid and nano graphene oxide (PANGO)[J].ACS Nano,2013,7(7):5882-5891.

[63] Allen M J,Tung V C,Kaner R B.Honeycomb carbon:a review of graphene[J].Chemical Reviews,2010,110 (1):132-145.

[64] Liu H,Ye T,Mao C.Fluorescent carbon nanoparticles derived from candle soot[J].Angew Chem Int Ed,2007,46(34):6473-6475.

[65] Zheng X,Liu Q,Jing C,et al.Catalytic gold nanoparticles for nanoplasmonic detection of DNA hybridization[J].Angew Chem Int Ed,2011,50(50):11994-11998.

[66] Wang F,Banerjee D,Liu Y S,et al.Upconversion nanoparticles in biological labeling,imaging,and therapy[J].Analyst,2010,135(8):1839-1854.

[67] Haase M,Schafer H.Upconverting nanoparticles[J].Angew Chem Int Ed,2011,50(26):5808-5829.