鄭文振+蒲榮+向華國

作者簡介：鄭文振，男，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事皮膚性病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。Email:zwz247@163.com.

鄭文振1，蒲榮1，向華國2

(1.廣東省東莞市寮步醫(yī)院，東莞 523400；2.廣東省深圳市福永人民醫(yī)院，深圳 518103)

【摘要】目的比較反向線點(diǎn)雜交技術(shù)（RLB）、實(shí)時(shí)熒光PCR(FQPCR)及培養(yǎng)法在檢測泌尿生殖道淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae,NG）感染中的應(yīng)用情況。

方法同時(shí)采集158例患者2份泌尿生殖道標(biāo)本，提取其中1份標(biāo)本NGDNA，PCR擴(kuò)增NG 16S rRNA基因，然后與固定在尼龍膜上的特異性寡核苷核探針反向線點(diǎn)雜交；同時(shí)運(yùn)用FQPCR檢測NG的感染情況；另1份標(biāo)本及時(shí)進(jìn)行NG巧克力培養(yǎng)。

結(jié)果PCR擴(kuò)增NG 16S rRNA基因的片段長度為412bp，具有較好的特異性，RLB檢測158例標(biāo)本中NG陽性為45例，陽性率為28.48%；FQPCR檢測NG陽性為50例，陽性率為31.65%，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞005）；而培養(yǎng)法檢測NG陽性為25例，陽性率為15.82%，明顯低于RLB和FQPCR（P＜001）。

結(jié)論 與培養(yǎng)法相比，RLB與FQPCR在檢測NG方面具有簡便、快速且敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，且二者無明顯差別。

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【關(guān)鍵詞】淋病奈瑟氏菌；聚合酶鏈反應(yīng)；核酸雜交；寡核苷核探針

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中圖分類號：R691.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：10031383(2014)03031004

DOI:10.3969/j.issn.10031383.2014.03.021

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Comparative study of three methods for detecting Neisseria gonorrhoeae infection in urogenital tract

ZHENG Wenzhen1,PU Rong1,XIANG Huaguo2

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(1.Liaobu Hospital of Dongguan,Dongguan 523400;2.Fuyong People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518103,Guangdong,China）

【Abstract】ObjectiveTo compare the application of reverse line blot hybridization assay (RLB),realtime fluorescent PCR(FQPCR) and cultivation methods in detecting Neisseria gonorrhoeae(NG) infection in urogenital tract.

MethodsTwo urogenital specimens of 158 patients were collected at the same time, from which NGDNA and PCR amplification NG 16s rRNA genes of one of the specimens were extracted to hybridize with the reverse line blot of specific oligonucleotide probe fixed on nylon membrane.FQPCR was used to detect NG infection at the same time.NG chocolate culture was performed in the other specimen.

Results Fragment length of PCR amplification NG 16S rRNA gene was 412bp with good specificity.RLB detection showed that 45 out of 158 cases had positive NG.The positive rate was 28.48%.Under the detection of FQPCR,NG of 50 cases were positive with a positive rate of 31.65%. There was no significant difference between two methods(P＞0.05).However,chocolate culture detection showed that 25 cases got positive NG with a positive rate of 15.82%,significantly lower than those of RLB and FQPCR (P＜0.01).

ConclusionCompared with chocolate culture,the RLB and FQPCR are simple,rapid and highly sensitive and there isno significant difference between the two methods.

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【Key words】Neisseria gonorrhoeae;polymerase chain reaction;nucleic acid hybridization;oligonucleotide probe

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae,NG）感染泌尿生殖道引起的淋病是一種常見的性傳播疾病(STI)，每年全世界大約有幾百萬人感染［1］。NG感染引起的淋病如其他STI一樣，可合并感染，一種病原體感染可以成為另一種病原體感染的危險(xiǎn)因素，因此盡早發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療就顯得尤為重要［2］。傳統(tǒng)的檢測方法革蘭氏染色涂片法檢測G-陰性雙球菌其陽性率低，如采用培養(yǎng)法耗時(shí)長且受標(biāo)本取材及送檢條件的影響，陽性率較低。所以選擇更加特異、敏感的檢測方法檢測NG具有十分重要的意義。近年來核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAATs）在NG感染檢測方面發(fā)揮了重要作用，特別是PCR及其衍生技術(shù)，本文以NG16S rRNA基因作為靶基因設(shè)計(jì)PCR引物和探針，建立PCR結(jié)合反向線點(diǎn)雜交技術(shù)檢測NG，并與實(shí)時(shí)熒光PCR和培養(yǎng)法檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2013年3月1日至2014年2月10日前來東莞市寮步醫(yī)院皮膚性病科就診患者的泌尿生殖道標(biāo)本；每人同時(shí)收集2份標(biāo)本，1份用于反向線點(diǎn)雜交技術(shù)（RLB）及實(shí)時(shí)熒光PCR(FQPCR)檢測，另1份用于培養(yǎng)。158例患者中男性105例，其中尿液標(biāo)本11例，尿道分泌物標(biāo)本94例；女性53例，其中尿液標(biāo)本5例，陰道分泌物標(biāo)本48例。標(biāo)準(zhǔn)菌株如淋病奈瑟菌（WHO A1, A2, A3）、沙眼衣原體（ATCC VR902B）、解脲脲原體（ATCC 29342）及人型支原體（PG 21）為本院保藏菌株，腦膜炎奈瑟菌為本院臨床分離株。

1.2主要試劑與儀器

HotStar Taq酶由QIAGEN公司生產(chǎn)，Biobyne C尼龍膜由Pall公司生產(chǎn)，鏈親和素過氧化物酶接合物由Roch公司生產(chǎn)。TM淋球菌平板培養(yǎng)基為浙江威昱生物科技有限公司生產(chǎn)。ABI Steponeplus PCR擴(kuò)增儀產(chǎn)自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Shellab雜交箱由Eppendorf公司生產(chǎn)。淋球菌核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑由上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。VITEK2全自動微生物鑒定儀由法國梅里埃生物公司生產(chǎn)。

1.3PCRRLB檢測NG的反應(yīng)體系

PCR各組分含量為50 mol/L引物各0.25 μl，5 U/L HotStar Taq 酶0.2 μl，10×buffer 2.5 μl，4×10 mmol/L dNTP 0.25 μl，25 mol/L MgCl2 3 μl，模板5 μl，補(bǔ)水至25 μl。循環(huán)參數(shù)為95℃ 15 min后，95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反義引物SR60 5端用生物素標(biāo)記，檢測探針SR83的5端用氨基標(biāo)記（見表1）。標(biāo)記BiodyneC尼龍膜用0.5 μmol/L NaHCO3(pH8.4)稀釋SR83探針濃度為0.625 μmol/L，具體方法參見文獻(xiàn)［3，4］。

表1PCRRLB檢測淋病奈瑟氏菌的引物和探針序列

項(xiàng)目解鏈溫度(℃)b 靶基因Genbank序列號序列

Primer

SR6060.516S rRNAX07714536 TATTACCGCGGCTGCTG 520

〗

SR6860.916S rRNAX07714125 ATCGGAACGTACCGGGTAG 143

Probe

SR8360.316S rRNAX07714460 GTTGCCAATATCGGCG 475

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1.4RLB檢測NG

參考文獻(xiàn)［5］，加170 μl 2×SSPE/0.1%SDS溶液入1.5 ml EP反應(yīng)管中，取5 μl PCR產(chǎn)物與其混勻后100℃煮10 min，然后置于冰中迅速冷卻。將已與探針結(jié)合的尼龍膜用60℃ 2×SSPE/0.1%SDS液漂洗5 min，將膜置于Miniblotter反應(yīng)板上，在反應(yīng)板的槽中分別加入150 μl 2×SSPE/0.1%SDS和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合液。60℃雜交1 h，將膜置于60℃ 2×SSPE/0.5%SDS溶液中洗2次，每次10 min。然后加入2×SSPE/0.5%SDS和1/5000鏈親和素過氧化物酶接合物混合液，42℃孵育1 h，再用42℃ 2×SSPE/05%SDS液洗膜2次，每次10 min。最后在室溫下用2×SSPE液洗膜2次，每次5 min，加ECL覆蓋于膜上，1 min后將膜顯影5 min。

1.5特異性檢測

用PCRRLB檢測淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲脲原體、人型支原體及腦膜炎奈瑟菌。

1.6實(shí)時(shí)熒光PCR檢測NG

采用核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記探針雜交方法對NG的DNA進(jìn)行定性檢測。PCR擴(kuò)增的總反應(yīng)體系為25 μl，DNA模板為4 μl。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 7 s，60℃ 50 s（采集熒光），共40個(gè)循環(huán)，CT<38判為陽性。

1.7NG的培養(yǎng)及鑒定

及時(shí)保溫送檢泌尿生殖道標(biāo)本，接種于已預(yù)溫的TM平板上，置5%～10%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，36.5℃培養(yǎng)24～36 h，觀察菌落形態(tài)，挑取可疑菌落利用梅里埃VITEK2全自動微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCRRLB檢測NG的特異性

16S rRNA PCR引物分別擴(kuò)增沙眼衣原體、解脲脲原體、人型支原體結(jié)果均為陰性；可擴(kuò)增淋病奈瑟菌412bp片段（圖1），且只與相應(yīng)的特異性探針雜交。16S rRNA PCR引物可以擴(kuò)增腦膜炎奈瑟菌，但不與NG探針雜交。

圖116S rRNA PCR引物各病原體凝膠電泳圖譜

1：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；2：沙眼衣原體；3：解脲脲原體；4：人型支原體；5：腦膜炎奈瑟菌； 6：淋病奈瑟菌（WHO A1）；7：淋病奈瑟菌（WHO A2）；8：淋病奈瑟菌（WHO A3）

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2.2三種方法在檢測臨床標(biāo)本中的比較

158例患者中，經(jīng)PCRRLB檢測NG為陽性45例，陽性率為28.48%； FQPCR檢測NG為陽性50例，陽性率為31.65%；二者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而培養(yǎng)法檢測NG陽性為25例，陽性率為15.82%，明顯低于RLB和FQPCR（P＜001）。見表1。

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表1三種方法在檢測臨床標(biāo)本NG感染中的比較(n=158)

標(biāo)本類型RLB陽性陰性

陽性陰性

培養(yǎng)法陽性陰性

尿液412511214

尿道分泌物346037571975

陰道分泌物741840444

合計(jì)45▲11350▲10825133

注：與培養(yǎng)法比較，▲P＜001。

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3討論

從圖1可以看出選用NG編碼大亞基核糖體的16S rRNA基因作為檢測靶基因，其引物不僅能擴(kuò)增淋病奈瑟氏菌，還能擴(kuò)增腦膜炎奈瑟氏菌，但不能擴(kuò)增其他非奈瑟氏菌屬病原體，如沙眼衣原體、解脲脲原體、人型支原體等泌尿生殖道病原體，說明引物具有屬的特異性而不具有種的特異性。RLB檢測時(shí)NG的特異性檢測探針只與NG雜交，不與腦膜炎奈瑟氏菌雜交，避免了假陽性的發(fā)生。選擇不同的基因位點(diǎn)作為檢測NG的靶基因其檢測結(jié)果不盡一致，考慮假陽性的同時(shí)也要考慮假陰性的發(fā)生，少部分菌株出現(xiàn)質(zhì)粒缺失也會出現(xiàn)假陰性。結(jié)合多種方法對NG進(jìn)行檢測可以有效避免上述問題的發(fā)生。RLB技術(shù)是近年來在RDB的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的以尼龍膜為載體的低密度膜芯片技術(shù)［6］，結(jié)合力強(qiáng)，韌性強(qiáng)，能重復(fù)使用。需要用生物素標(biāo)記反義引物的5端，化學(xué)發(fā)光檢測能有效放大檢測信號，敏感度高。與同位素標(biāo)記探針結(jié)合放射性自顯影技術(shù)相比，該技術(shù)無放射性污染。

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從表1可以看出FQPCR檢測NG的陽性率為31.65%，略高于RLB的陽性率（28.48%），二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡艿闹饕蚴嵌哌x取的檢測靶基因不同，另外就是FQPCR是通過儀器自動實(shí)時(shí)探測熒光信號，敏感度高于化學(xué)發(fā)光膠片顯影。FQPCR是目前應(yīng)用得比較普遍的檢測NG的分子生物學(xué)方法，市場上品牌眾多，選用的檢測靶基因不盡相同，應(yīng)用于臨床之前也應(yīng)對其進(jìn)行驗(yàn)證，包括與其他檢測原理不同的方法進(jìn)行比較。培養(yǎng)法檢測NG的陽性率為15.82%，明顯低于RLB和FQPCR，相比于PCR及其衍生技術(shù)培養(yǎng)法檢測NG活菌，該菌抵抗力低，對標(biāo)本的要求較高，要求保溫、及時(shí)送檢和接種，特別是冬天，最好是取材后馬上接種，否則陽性率較低，但就目前而言，培養(yǎng)法仍是檢測NG的金標(biāo)準(zhǔn)，缺點(diǎn)是耗時(shí)長，一般需要3天，陽性率較低。

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不同研究人群包括不同癥狀、不同性別、不同受教育程度、不同類型標(biāo)本NG的檢出情況都會有所區(qū)別，一般情況下男性陽性率要高于女性［7，8］。本研究對三種不同方法檢測NG進(jìn)行了比較，著重對RLB檢測NG進(jìn)行了評價(jià)，其檢測結(jié)果與FQPCR無明顯差異。RLB和FQPCR的敏感性都明顯高于培養(yǎng)法，可以有效防止漏檢，這三種方法在一定條件下可以互相補(bǔ)充。

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參考文獻(xiàn)

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［8］ 莫俊鑾，張麗君，楊慧，等.1010例性病門診患者泌尿生殖道病原體感染分析［J］. 中國艾滋病性病，2012，18 (12):871873.

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(收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-06-10)

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(編輯：潘明志)

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不同研究人群包括不同癥狀、不同性別、不同受教育程度、不同類型標(biāo)本NG的檢出情況都會有所區(qū)別，一般情況下男性陽性率要高于女性［7，8］。本研究對三種不同方法檢測NG進(jìn)行了比較，著重對RLB檢測NG進(jìn)行了評價(jià)，其檢測結(jié)果與FQPCR無明顯差異。RLB和FQPCR的敏感性都明顯高于培養(yǎng)法，可以有效防止漏檢，這三種方法在一定條件下可以互相補(bǔ)充。

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(收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-06-10)

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(編輯：潘明志)

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不同研究人群包括不同癥狀、不同性別、不同受教育程度、不同類型標(biāo)本NG的檢出情況都會有所區(qū)別，一般情況下男性陽性率要高于女性［7，8］。本研究對三種不同方法檢測NG進(jìn)行了比較，著重對RLB檢測NG進(jìn)行了評價(jià)，其檢測結(jié)果與FQPCR無明顯差異。RLB和FQPCR的敏感性都明顯高于培養(yǎng)法，可以有效防止漏檢，這三種方法在一定條件下可以互相補(bǔ)充。

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［8］ 莫俊鑾，張麗君，楊慧，等.1010例性病門診患者泌尿生殖道病原體感染分析［J］. 中國艾滋病性病，2012，18 (12):871873.

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(收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-06-10)

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(編輯：潘明志)

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