王 輝， 陳 驍， 項(xiàng)夏霖， 彭 鑫， 王苑芳， 劉填桂， 黃樹(shù)林， 邵紅偉

(廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，生物制藥研究所， 廣東 廣州 510006)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver di-sease, NAFLD)是一種排除過(guò)量飲酒和其它明確的肝損傷因素之外所致的類似酒精性脂肪性肝病理改變的綜合征，包括單純脂肪肝(steatosis)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化及肝硬化[1]。隨著生活水平的提高，與膳食結(jié)構(gòu)、肥胖、代謝性疾病密切相關(guān)的NAFLD發(fā)病率逐漸增高并呈現(xiàn)全球化、低齡化趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，西方國(guó)家的成人NAFLD的發(fā)病率達(dá)20%～30%，其中NASH為2%～3%，約1/3 NASH病人并發(fā)進(jìn)展性肝纖維化和肝硬化[2]。我國(guó)脂肪肝的發(fā)病率已占平均人口的10%，在肥胖、糖尿病高危人群中可高達(dá)50%～60%。國(guó)外大量臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)NAFLD已成為西方國(guó)家繼HBV和HCV后引起肝癌的第3個(gè)重要原因[3]。

游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)與脂肪肝發(fā)病密切相關(guān)。脂肪肝病人常表現(xiàn)為肝臟攝取和合成FFA增加，F(xiàn)FA在肝線粒體內(nèi)氧化和利用減少。FFA增加超過(guò)肝組織的氧化能力使FFA過(guò)度沉積造成脂毒性，表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性和脂性凋亡[4]。本研究利用FFA混合物作用于人肝細(xì)胞L-02，觀察其對(duì)L-02細(xì)胞脂肪變性、細(xì)胞損傷及脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而為研究NAFLD的發(fā)病機(jī)理和發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

油酸(oleic acid)、軟脂酸(palmitic acid)、牛血清白蛋白、尼羅紅(Nile red)、MTT和DMSO購(gòu)自Sigma；人L-02細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；BCA法蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；甘油三酯(triglyceride，TG)酶法測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基和Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；Annexin V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega；SYBR Fast MasterMix(2×)購(gòu)自Roche。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及給藥 人肝細(xì)胞系L-02用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均采用處于2～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。 L-02細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)密度達(dá)到80%以上，分別用正常培養(yǎng)基和0.5、1、2 mmol/L FFA混合物(油酸∶軟脂酸=2∶1)培養(yǎng)24 h后測(cè)定指標(biāo)。

2.2激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞脂肪堆積 尼羅紅可對(duì)脂肪特異性染色。L-02細(xì)胞接種于放有蓋玻片的35 mm平板中爬片生長(zhǎng)至密度80%以上，用不同濃度FFA混合物培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞用1 μmol/L 尼羅紅染液1 mL室溫避光染色15 min，奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡(488 nm excitation/543 nm emission)觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積情況。

2.3流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞脂肪堆積 不同濃度FFA混合物培養(yǎng)24 h的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞后用冰PBS洗滌細(xì)胞2次。細(xì)胞重懸于1 μmol/L 尼羅紅染液1 mL，小心吹打混勻。室溫避光放置30 min染色，1 000 r/min離心5 min，冰PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于1 mL PBS，流式細(xì)胞儀(490 nm excitation/570 nm emission;Beckman Coulter)隨機(jī)計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

2.4TG測(cè)定 收集FFA混合物處理后的細(xì)胞，TG含量用組織細(xì)胞酶法測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，細(xì)胞蛋白濃度用BCA法蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。不同濃度FFA混合物處理接種于96孔板的L-02細(xì)胞(細(xì)胞密度50%)24 h后，每孔加入10 μL MTT儲(chǔ)存液(5 g/L)。培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基每孔加入DMSO 100 μL，室溫振蕩5 min后多功能酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞存活率計(jì)算：

2.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 Annexin V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒分析細(xì)胞的凋亡情況。用不同濃度FFA混合物培養(yǎng)24 h的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞用冰PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min。細(xì)胞重懸于500 μL binding緩沖液 ，分別加入5 μL Annexin V和5 μL PI，小心吹打混勻。室溫避光放置15 min，流式細(xì)胞儀隨機(jī)計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7ALT和AST測(cè)定 FFA混合物處理L-02細(xì)胞24 h后，吸取培養(yǎng)上清用ALT和AST測(cè)定試劑盒340 nm波長(zhǎng)處測(cè)定1 min和2 minA值，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書利用吸光度差值ΔA計(jì)算ALT和AST活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脂代謝相關(guān)基因表達(dá) Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA并取5 μg RNA用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein,ADR)上游引物5′-gggatccctgtctaccaagc-3′，下游引物5′-agatgtcgcctgccatcacc-3′。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1,SREBP-1)上游引物5′-acggcagcccctgtaacgaccactgtga-3′，下游引物5′-tgccaagatggttccgccactcaccagg-3′。β-actin上游引物5′-gactacctcatgaagatc-3′，下游引物 5′-gatccacatctgctggaa-3′。用Roche Light Cycler 480II實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2× SYBR Fast Master Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min， 1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。檢測(cè)熒光信號(hào)并分析循環(huán)閾值(Ct)，ΔCt為目的基因與內(nèi)參照β-actin循環(huán)閾值的差值，ΔΔCt為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組ΔCt的差值，采用公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FFA混合物誘導(dǎo)肝細(xì)胞L-02脂肪變性

如圖1所示，F(xiàn)FA混合物處理后，細(xì)胞內(nèi)脂滴成環(huán)狀位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，隨脂肪酸濃度增加L-02細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴增大及數(shù)量增多。圖2顯示，各濃度FFA混合物可劑量依賴性增加肝細(xì)胞脂肪堆積。如圖3所示，各濃度FFA混合物可劑量依賴性增加肝細(xì)胞甘油三酯含量。與對(duì)照組相比，1 mmol/L FFA混合物處理的肝細(xì)胞甘油三酯含量增高2.6倍，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]的NAFLD病人的情況(2.7倍)基本相同。

Figure 1. FFA mixture induced lipid accumulation in L-02 cells after Nile red staining by confocal laser scanning microscopy (×400).

Figure 2. Flow cytometric analysis of L-02 cell lipid content after FFA mixture treatment and Nile red staining. The flow cytometry diagram is a representative of three independent experiments.

Figure 3. Triglyceride(TG)content in L-02 cells treated with FFA mixture. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

2 FFA混合物對(duì)肝細(xì)胞L-02損傷的影響

如圖4所示，0.5 mmol/L和1 mmol/L脂肪酸混合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用，而2 mmol/L脂肪酸混合物可降低L-02細(xì)胞存活率(P<0.05)。如圖5所示，與對(duì)照組早期凋亡率(3.400±0.414)%和晚期凋亡率(2.600±0.402)%相比，2 mmol/L FFA混合物處理的L-02細(xì)胞早期凋亡率(6.275±1.368)%和晚期凋亡率(7.625±1.810)%增加(P<0.05)，而0.5 mmol/L和1 mmol/L FFA混合物對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。與對(duì)照組相比，各濃度FFA混合物培養(yǎng)上清中ALT和AST水平無(wú)顯著上升，見(jiàn)表1，說(shuō)明FFA混合物處理未造成L-02細(xì)胞轉(zhuǎn)氨酶泄漏。1 mmol/L FFA混合物可誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性但又不造成肝細(xì)胞損傷。

Figure 4. Effects of FFA mixture on L-02 cell viability.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

Figure 5. Apoptosis-inducing effects of FFA mixture treatment on L-02 detected by flow cytometry.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

3 FFA混合物上調(diào)L-02細(xì)胞ADRP和SREBP-1 mRNA的表達(dá)

與對(duì)照組相比，1 mmol/L FFA混合物作用后，L-02細(xì)胞的ADRP和SREBP-1 mRNA的表達(dá)分別上調(diào)2.660和2.758倍，見(jiàn)圖6。

表1 不同濃度FFA混合物對(duì)L-02細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT和AST活性的影響

討 論

油酸和軟脂酸是正常人和NAFLD病人肝臟中含量最豐富的脂肪酸[5]，添加油酸和軟脂酸也是脂肪肝細(xì)胞模型研究中最常見(jiàn)的方法。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)多脂肪酸沉積在肝臟可引起一系列代謝改變并最終導(dǎo)致對(duì)肝細(xì)胞的脂毒性[4]。不同脂肪酸的作用差異較大，飽和脂肪酸軟脂酸可誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，而不飽和脂肪酸油酸可減少和抑制軟脂酸對(duì)肝細(xì)胞的毒性[6]。Gómez-Lechón等[5]用不同比例的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸來(lái)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)軟脂酸的比例越高，對(duì)肝細(xì)胞的脂毒性越大。脂肪酸血清濃度為0.2～2 mmol/L，因此我們選用0.5、1和2 mmol/L這3個(gè)濃度的FFA混合物，參照人體油酸和軟脂酸的比例，以2∶1 比例聯(lián)合作用于肝細(xì)胞，觀察肝細(xì)胞的脂毒性。

Figure 6. The mRNA expression levels of two lipid metabolism-related molecules in FFA mixture-treated L-02 cells.ADRP: adipose differentiation-related protein; SREBP-1: sterol regulatory element-binding protein 1. Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.

在用于脂肪肝研究的細(xì)胞中，人原代肝細(xì)胞特性最接近人肝臟，但細(xì)胞來(lái)源缺乏。另一常用于脂肪肝研究的細(xì)胞是人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2，但腫瘤細(xì)胞內(nèi)通常存在能量代謝過(guò)程的改變，如脂肪酸合成增加[7-8]和涉及脂質(zhì)代謝過(guò)程的甲胎蛋白高表達(dá)[9]。L-02細(xì)胞是永生化正常人肝細(xì)胞系，已被研究者廣泛應(yīng)用于脂肪肝的機(jī)理和藥物篩選研究[10-11]，因此我們?cè)诒狙芯恐胁捎昧薒-02細(xì)胞作為受試對(duì)象。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積均證實(shí)1和2 mmol/L FFA混合物可明顯誘導(dǎo)肝細(xì)胞L-02脂肪變性。對(duì)細(xì)胞存活率、凋亡和培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)氨酶的檢測(cè)進(jìn)一步確定了1 mmol/L FFA混合物未造成L-02細(xì)胞明顯損傷，而2 mmol/L FFA混合物對(duì)L-02具有毒性，這也與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12-13]。

脂代謝相關(guān)基因與肝臟脂肪酸合成和積聚密切相關(guān)。ADRP是形成細(xì)胞內(nèi)脂滴的主要成分，在激活和貯存脂滴過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可作為鑒定脂肪肝疾病的標(biāo)志蛋白[14]。通過(guò)基因敲除和反義核苷酸可使ADRP含量降低，從而逆轉(zhuǎn)脂肪肝，改變脂類代謝[15]。SREBP-1是甘油三酯代謝中的重要轉(zhuǎn)錄因子, 可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多個(gè)脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶[16-17]，其在肝臟過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂變[18]。為進(jìn)一步明確1 mmol/L FFA混合物誘導(dǎo)肝脂肪變性的機(jī)制，我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)證實(shí)1 mmol/L FFA混合物可上調(diào)肝細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因ADRP和SREBP-1的表達(dá)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] 周 鑫, 韓德五, 李素紅,等.非酒精性脂肪性肝病在代謝綜合征相關(guān)的2型糖尿病發(fā)病中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(7): 1352-1359.

[2] Gentile CL, Pagliassotti MJ. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease [J]. J Nutr Biochem, 2008, 19(9): 567-576.

[3] 鄭 剛.非酒精性脂肪性肝病與肝癌關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2012, 21(3): 216-220.

[4] 程 媛,尚 靖,張陸勇.脂毒性與非酒精性脂肪肝的研究進(jìn)展[J].華西醫(yī)學(xué), 2008,23(6)：1482-1484.

[5] Gómez-Lechón MJ, Donato MT, Martínez-Romero A, et al. A human hepatocellularinvitromodel to investigate steatosis [J]. Chem Biol Interact, 2007, 165(2):106-116.

[6] Malhi H, Gores GJ. Molecular mechanisms of lipotoxicity in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Semin Liver Dis, 2008, 28(4):360-369.

[7] 鄭 杰. 腫瘤生物合成的異常及其臨床應(yīng)用[J]. 腫瘤, 2012, 32(1):74-78.

[8] Menendez JA, Lupu R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis [J]. Nat Rev Cancer, 2007, 7(10):763-777.

[9] 李朝英, 李 剛. 甲胎蛋白的生物學(xué)功能 [J]. 世界華人消化雜志, 2011, 19(14):1436-1440.

[10] 王 川，亢渝俊，姜 政，等.水甘油通道蛋白9短發(fā)夾RNA的構(gòu)建與篩選及其對(duì)非酒精性脂肪性肝病細(xì)胞模型的作用[J].中華肝臟病雜志, 2013, 21(3):222-227.

[11] Cao J, Feng XX, Yao L ,et al. Saturated free fatty acid sodium palmitate-induced lipoapoptosis by targeting glycogen synthase kinase-3β activation in human liver cells[J]. Dig Dis Sci, 2014, 59(2):346-357.

[12] Feldstein AE, Werneburg NW, Canbay A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-alpha expression via a lysosomal pathway [J]. Hepatology, 2004,40(1):185-194.

[13] Wu X, Zhang L, Gurley E, et al. Prevention of free fatty acid-induced hepatic lipotoxicity by 18beta-glycyrrhetinic acid through lysosomal and mitochondrial pathways [J]. Hepatology, 2008, 47(6):1905-1915.

[14] 劉 陽(yáng), 高士爭(zhēng), 趙素梅. ADRP在脂滴形成中的作用 [J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué), 2013, 3(8):44-46.

[15] 胡成穆,曹 琦, 李 俊. 酒精性脂肪肝脂質(zhì)代謝研究進(jìn)展 [J]. 安徽醫(yī)藥, 2012, 16 (8):1045-1047.

[16] 蔣 越, 高運(yùn)臻,潘玉春,等.固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白及其靶基因在脂肪代謝中的研究進(jìn)展 [J]. 豬業(yè)科學(xué),2009,(11):94-98.

[17] 湯曉麗, 鄧立彬,林加日,等. 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1及其靶基因網(wǎng)絡(luò) [J]. 遺傳, 2013, 35(5):607-615.

[18] Higuchi N, Kato M, Shundo Y, et al. Liver X receptor in cooperation with SREBP-1c is a major lipid synthesis regulator in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Hepatol Res, 2008, 38(11): 1122-1129.