靶向caspase-8小發(fā)夾RNA減輕去血清/缺氧誘導的人骨髓間充質干細胞凋亡*

袁偉偉， 林秋雄， 朱杰寧， 李曉紅， 符永恒， 劉曉穎， 譚虹虹， 鄧春玉， 單志新

(廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院, 廣東省心血管病研究所，廣東 廣州 510080)

急性心肌梗死仍是世界公共衛(wèi)生一大難題，現(xiàn)有治療方法的療效有限。心肌細胞治療是一種再生、修復損傷心肌的治療策略。已有很多不同組織來源的干細胞、祖細胞被用于實驗性或臨床治療研究，如胚胎干細胞、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、造血干細胞、新生兒或胎兒心臟干細胞、骨骼肌成肌細胞和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)等[1-4]。MSCs是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，可以在不同的誘導條件下分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經細胞、心肌細胞等，可能是組織工程、再生醫(yī)學領域中重要的種子細胞[5]。MSCs已在臨床前研究中得到了廣泛的測試，并且已有幾個臨床試驗評估其在心肌梗死治療中的臨床療效[6-9]。然而，由于梗死心肌中缺血、炎癥等惡劣的微環(huán)境使得MSCs的移植率和存活率低下，大大限制了MSCs的治療效果。近年來，人們嘗試通過基因修飾MSCs來提高其移植后的存活率，并取得了一定的效果；已報道用于修飾MSCs的基因包括Bcl-2、間隙連接蛋白43 (connexin-43)、血紅素氧合酶 (heme oxygenase-1,HO-1)、熱休克蛋白20 (heat-shock protein 20, HSP-20)、磷脂酰肌醇3-激酶C2α(phosphatidylinositol 3-kinases C2α, PI3K-C2α)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)和血管生成素1(angiopoietin-1,Ang1)等[10]。

鑒于過表達抗凋亡蛋白可增強MSCs的心肌再生作用[11-13]，我們認為通過沉默促凋亡基因表達也可以提高MSCs的存活率。本研究制備了表達人caspase-8小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)的重組腺病毒，檢測了腺病毒介導的caspase-8 shRNA對人MSCs中caspase-8表達的抑制作用及對去血清/缺氧誘導的MSCs凋亡的保護作用。

材 料 和 方 法

1 細胞和載體

hMSCs按我們已報道的方法分離、培養(yǎng)和保存[14]；HEK293T購自ATCC；質粒pAdTrack-CMV(攜帶GFP報告基因)、pAdEasy-I和大腸桿菌菌株BJ5183購自Stratagen；大腸桿菌菌株DH-5α由本研究室保存。

2 主要試劑

質粒提取試劑盒和DNA 回收試劑盒(Qiagen)；Trizol試劑、逆轉錄酶和定量PCR Master Mix購自Invitrogen；DNA聚合酶和限制性內切酶(TaKaRa)；胎牛血清和α-DMEM(HyClone)；L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、磷酸鹽緩沖液(PBS)、Lipofectamine 2000轉染試劑、293 FectinTM轉染試劑和0.05% 胰蛋白酶、annexin V/PI(Invitrogen)；caspase-8活性檢測試劑(Promega)；caspase-8抗體和GAPDH抗體(Abcam)；所用PCR引物由英濰捷基(上海)公司合成。

3 主要方法

3.1PCR擴增法制備caspase-8 shRNA編碼DNA 參考我們已報道方法[15]，簡述如下。分別針對人caspase-8基因的2個靶序列：aagggtcatgctctatcagat和cagtgccagacacagtctgta，并根據(jù)腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV 多克隆位點序列，設計合成用于制備基于微小RNA-155骨架序列(back bone)的caspase-8 shRNA模板DNA的PCR引物。靶向aagggtcatgctctatcagat的caspase-8 shRNA模板DNA的PCR上游引物ATGCGGTACCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATG-CTGATCTGATAGAGCATGACCCTTGTTTTGGCCACT-GACTGAC (KpnI)，下游引物GCATAAGCTTCAGCAATTTGTTCCATGTGAATGCTAGTAACAGGCATCA-TACACTGATCTGATAGAGTGACCCTTGTCAGTCAGT-GGCCAAAAC (HindIII)。靶向cagtgccagacacagtctgta的caspase-8 shRNA模板DNA的PCR上游引物ATGCGGTACCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATGCTGT-ACAGACTGTGTCTGGCACTGGTTTTGGCCACTGACT-GAC (KpnI)，下游引物GCATAAGCTTCAGCAATTTGTTCCATGTGAATGCTAGTAACAGGCATCATACACTG TACAGACTGTGTGGCACTGGTCAGTCAGTGGCCAA-AAC (HindIII)。分別利用2對PCR引物自身為模板進行PCR反應，條件為94 ℃ 2 min，后連續(xù)31個循環(huán), 每個循環(huán)內94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s, 完成最后1個循環(huán)后72 ℃延伸3 min。之后進行2%瓊脂糖凝膠電泳, 用凝膠提取試劑盒純化PCR 產物。

3.2人caspase-8 shRNA腺病毒穿梭質粒的構建 用KpnI+HindIII分別酶切人caspase-8 shRNA模板DNA和pAdTrack-CMV質粒。純化酶切產物, 利用T4DNA連接酶于16 ℃反應4～6 h。將連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α, 鋪50 mg /L Kana+/LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。對獲得的陽性克隆重組質粒行KpnⅠ+HindIII酶切和DNA測序鑒定。

3.3細菌內同源重組獲得caspase-8 shRNA重組腺病毒質粒 用PmeⅠ酶切重組穿梭質粒pAdTrack-caspase-8 shRNA，然后將線性化質粒與腺病毒骨架質粒pAdeasy-I共轉化BJ5183感受態(tài)菌，鋪50 mg/L Kana+/LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。用堿裂解法提取擴增后的最小陽性克隆的質粒DNA, 分別行PCR和PacⅠ酶切鑒定。將鑒定正確的重組腺病毒質粒轉入感受態(tài)DH5α菌, 挑取克隆擴增, 提取質粒保存。

3.4Caspase-8 shRNA重組腺病毒在HEK293細胞中的包裝及擴增 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人胚腎293細胞。在轉染前24 h, 將106HEK293細胞鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶內。當細胞豐度達到60%～70%時, 用293fectinTM試劑將PacI線性化的caspase-8 shRNA重組腺病毒質粒導入HEK293細胞。培養(yǎng)24～48 h后，在熒光顯微鏡下觀察重組腺病毒上共表達的綠色熒光蛋白(GFP)的表達。繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，用吸管小心吹打收集293細胞及上清培養(yǎng)基。在-70 ℃/37 ℃反復凍融裂解細胞3次后，用適量的細胞凍融裂解上清液再次感染HEK293細胞。2～3 d后，按照上述方法收集病毒上清，經過2～3次重復擴增后，獲得較高滴度的重組病毒。按上述方法，制備只表達標志蛋白GFP的對照重組腺病毒rAd-GFP。用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋高滴度的重組病毒，以不同感染復數(shù)(MOI值)感染hMSCs，以感染后24 h GFP表達確定合適的病毒感染MOI。

3.5去血清/缺氧處理hMSCs 將hMSCs鋪板24 h后至穩(wěn)定生長。更換為無血清培養(yǎng)基(N2飽和0.5 h)在0.1% O2、37 ℃培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基，在常氧，5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

3.6熒光定量PCR檢測基因表達 用Trizol 試劑提取hMSCs總RNA，用2 μg總RNA逆轉錄合成cDNA第1鏈，進行目的基因表達水平的定量檢測。Real-time PCR 條件如下：95 ℃ 1 min，94 ℃ 25 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40 個循環(huán)，72 ℃ 3 min。擴增的DNA產物以熒光染料SYBR Green I 標記，在每個循環(huán)結束時測定每孔SYBR GreenⅠ吸光度值。反應結束后對PCR 產物做55 ℃ 到95 ℃的融解曲線分析，12 ℃終止反應。以人GAPDH為內參照，引物序列如表1所示。實驗組與對照組間目的基因mRNA的相對表達水平用2-ΔΔCt方法[16]計算。

表1 實時定量RT-PCR實驗所用的引物

3.7Western blotting檢測caspase-8表達 用細胞蛋白裂解液處理hMSCs，收集細胞上清，行12% SDS-PAGE電泳。將細胞蛋白電轉至硝酸纖維素膜上，封閉電轉膜，再分別以兔抗caspase-8單抗為Ⅰ抗，羊抗兔IgG-HRP為Ⅱ抗孵育電轉膜。內參照蛋白選用GAPDH。用ECL+Plus試劑為底物，曝光X光片，顯色、定影。根據(jù)檢測caspase-8蛋白條帶和GAPDH蛋白條帶的灰度比值，進行細胞樣品中caspase-8蛋白表達的半定量分析。

3.8Annexin V/PI染色分析 用冰冷的PBS清洗hMSCs，離心，棄上清用annexin結合液重懸。調整細胞密度1×109cells/L，加5 μL Alexa Fluor 488 annexin V和1 μL PI工作液(100 mg/L)到每100 μL的細胞懸液中。室溫避光孵育15 min。流式細胞術檢測，發(fā)射波長為488 nm，F(xiàn)ITC-annexin V熒光檢測波長為(530±15) nm, PI熒光檢測波長為600 nm。

3.9caspase-8活性檢測 參照caspase-8活性檢測試劑盒操作說明，制備hMSCs細胞裂解液，利用Glomax2020發(fā)光檢測儀檢測hMSCs細胞的caspase-8活性。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件分析，滿足方差齊性時，組間比較用單因素方差分析；不滿足方差齊性時，組間比較用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 重組caspase-8 shRNA腺病毒的制備

經KpnI+HindIII酶切和DNA測序鑒定表明，分別針對人caspase-8基因靶序列aagggtcatgctctatcagat和cagtgccagacacagtctgta的caspase-8 shRNA腺病毒穿梭質粒pAd-Cap8 shRNA1和pAd-Cap8 shRNA2構建成功(本文未顯示)。熒光定量PCR結果顯示，轉染pAd-Cap8 shRNA1介導表達的Cap8 shRNA能有效抑制HEK293細胞中caspase-8 的mRNA表達，見圖1A。利用pAd-Cap8 shRNA1質粒和腺病毒骨架質粒pAdEasy-I繼續(xù)構建重組腺病毒質粒rAdTrack-Cap8 shRNA1。PacI酶切鑒定顯示，pAdTrack-CMV被切成6.0 kb和3.0 kb的片段，pAdEasy-I被切成33 kb的片段，而通過BJ5183菌重組的腺病毒質粒rAdTrack- Cap8 shRNA1被切成21.5 kb和4.5 kb的片段，說明pAd-Cap8 shRNA1和腺病毒骨架質粒發(fā)生了重組，見圖1B。重組Cap8 shRNA腺病毒質粒轉染HEK239細胞48 h后，有少量細胞表達綠色熒光蛋白，7～10 d后，全部HEK293細胞中表達GFP，細胞形成大量病毒斑、細胞發(fā)生融合及部分細胞漂浮，見圖1C，表明重組Cap8 shRNA腺病毒在HEK293細胞中成功包裝合成。經過2次擴增后，用反復凍融法收集包裝好的病毒上清。

Figure 1. Preparation of recombinant adenovirus carrying caspase-8 shRNA.A: the mRNA expression of caspase-8 in caspase-8 (Cap8) shRNA-modified HEK293 cells detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3. ##P<0.01 vs Vector. B: restriction endonuclease digestion of rAdTrack-Cap8 shRNA1 detected by electrophoresis through an 8 g/L agarose gel and ethidium bromide staining. M: DL15000 DNA ladder marker; 1: pAdEasy-I digested by Pac I; 2: rAdTrack-Cap8 shRNA1 digested by PacⅠ; 3: pAdTrack-CMV digested by PacⅠ. C: packaging of rAd-Cap8 shRNA in HEK293 cells.

2 腺病毒介導caspase-8 shRNA調控hMSCs中caspase-8的表達

當MOI為5時，重組caspase-8 shRNA腺病毒可有效感染hMSCs，hMSCs中有大量的GFP表達，見圖2A。Real-time PCR結果顯示，與hMSCs和陰性對照腺病毒感染的hMSCs相比，caspase-8 shRNA腺病毒感染的hMSCs中caspase-8 mRNA顯著降低(P<0.01)，見圖2B；Western blotting結果顯示，caspase-8 shRNA腺病毒感染的hMSCs中，caspase-8蛋白水平顯著降低(P<0.01)，見圖2C。

3 Caspase-8 shRNA抑制去血清/缺氧誘導的hMSCs凋亡

流式細胞術分析顯示，去血清和缺氧培養(yǎng)可顯著提高hMSCs凋亡率，而腺病毒介導的過表達caspase-8 shRNA可有效降低hMSCs的凋亡率(P<0.01)，見圖3A。Caspase-8活性分析結果顯示，去血清和缺氧培養(yǎng)的hMSCs中caspase-8活性顯著升高，而caspase-8 shRNA可顯著降低hMSCs中caspase-8活性(P<0.01)，見圖3B。

4 Caspase-8 shRNA增強hMSCs中HGF、IGF-1和Bcl-2的表達

利用real-time PCR檢測了hMSCs中與增殖、凋亡相關基因的表達。結果顯示，過表達caspase-8 shRNA的hMSCs中，HGF、IGF-1和Bcl-2 mRNA表達顯著增強(P<0.05，P<0.01)，而VEGF和Bcl-xL的表達變化不明顯，見圖4。

Figure 2. Adenovirus-mediated caspase-8 shRNA inhibited caspase-8 expression in hMSCs. A: green fluorescent protein expression in MSCs infected with rAd-GFP or rAd-Cap8 shRNA, respectively; B: caspase-8 mRNA expression in caspase-8 shRNA-overexpressing MSCs detected by real-time PCR assay; C: caspase-8 protein expression in caspase-8 shRNA-overexpressing MSCs detected by Western blotting.Mean±SD.n=3～5.##P<0.01 vs MSC; **P<0.01 vs MSC-vector.

Figure 3. Adenovirus-mediated caspase-8 shRNA inhibited apoptosis of MSCs under the condition of serum deprivation (SD) and hypoxia. A: Annexin V/PI staining; B: quantification of apoptotic cells; C: changes of caspase-8 activity. Mean±SD.n=3～5. **P<0.01 vs MSC; ##P<0.01 vs MSC-vector.

Figure 4. Adenovirus-mediated caspase-8 shRNA enhanced HGF, IGF-1 and Bcl-2 expression in hMSCs. Mean±SD.n=3～5.*P<0.05, **P<0.01 vs MSC; #P<0.05, ##P<0.01 vs MSC-vector.

討 論

MSCs能夠自我更新并可分化為成骨細胞、軟骨細胞、星形膠質細胞、神經元、骨骼肌細胞和心肌細胞等[5]。由于MSCs便于分離和體外擴增培養(yǎng)，并具有多分化潛能，使得MSCs成為用于心臟再生的一種有希望的干細胞來源。然而移植到損傷心肌內MSCs不能有效存活的情況極大地限制了MSCs的臨床應用。研究顯示[17-18]，超過99%的MSCs在注入到CB17 SCID成年小鼠左心室肌的4 d內死亡。鑒于心肌梗死區(qū)內的缺血微環(huán)境可能不利于MSCs存活和抵抗凋亡，如何提高MSCs在缺血條件下的生存能力對于MSCs成功應用于細胞治療將是至關重要的。

近年來，人們研究通過對MSCs進行預處理和基因修飾等不同的策略來提高MSCs移植后的存活率和治療效果。目前，已有大量的研究表明通過基因修飾手段可以提高MSCs移植后的存活率[10]。鑒于上述大多數(shù)措施增加MSCs生存能力是通過下調凋亡相關途徑實現(xiàn)的，因而，本文采取了直接抑制MSCs凋亡相關基因caspase-8表達的策略，研究過表達caspase-8 shRNA對MSCs抗凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，雖然低氧預適應能增強MSCs的生存[19-21]，但MSCs在長期的缺氧和缺乏營養(yǎng)條件下將發(fā)生顯著凋亡[22]。以往的研究顯示，線粒體途徑介導了缺氧和去血清誘導的MSCs凋亡，盡管缺氧和去血清可誘導Fas和FasL表達，升高caspase-8活性，但用caspase-8抑制劑zIEDT-fmk 并不能降低caspase-3活性，抑制MSCs凋亡[23]。而本文研究顯示，缺氧和去血清處理MSCs 6 h，繼續(xù)常氧和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，可誘導明顯的MSCs凋亡，伴有caspase-8活性的顯著升高；腺病毒介導過表達caspase-8 shRNA可降低caspase-8表達，抑制caspase-8活性，并有效降低缺氧和去血清誘導的MSCs凋亡。因此，利用caspase-8 shRNA特異降低MSCs的caspase-8表達和活性，可有效抑制缺氧和去血清誘導的MSCs凋亡。既往研究顯示，沉默MSCs中caspase-3表達可以促進細胞增殖，減少細胞凋亡[24]。鑒于caspase-3處于凋亡有序級聯(lián)反應的下游，結合本文研究結果，提示caspase-8活化參與的死亡受體凋亡途徑在缺氧和去血清處理MSCs凋亡中發(fā)揮重要作用。同時，本文定量PCR結果顯示，caspase-8 shRNA過表達的MSCs中抗凋亡相關HGF、IGF-1和Bcl-2表達顯著升高，提示上述基因表達增加也促進了MSCs抗缺氧和去血清誘導的凋亡作用。但caspase-8 shRNA過表達的MSCs中HGF、IGF-1和Bcl-2表達升高的調控機制有待于進一步研究。

本研究我們采用了基于miR-155前體骨架(stem-loop序列)的DNA模板表達caspase-8 shRNA，并獲得了有效的抑制MSCs中caspase-8表達的作用。既往的研究中，我們證實基于微小RNA骨架(如miR-30和miR-155)的DNA模板轉錄的目的基因shRNA比普通的發(fā)夾RNA能更有效抑制目的基因表達，而其中基于miR-155骨架DNA表達的目的基因shRNA的作用效能更好[15]。

因而，本文利用缺氧和去血清誘導的MSCs凋亡模型和腺病毒介導的基于miR-155前體骨架模板表達的caspase-8 shRNA，證實利用caspase-8 shRNA沉默MSCs中caspase-8表達可有效抑制MSCs凋亡。本文結果提示利用腺病毒介導caspase-8 shRNA修飾MSCs可能是一種提高MSCs移植后成活率的有效方法。

[參 考 文 獻]

[1] Segers VF, Lee RT. Stem-cell therapy for cardiac disease[J]. Nature, 2008, 451(7181): 937-942.

[2] Tongers J, Losordo DW, Landmesser U. Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges[J]. Eur Heart J, 2011, 32(10):1197-1206.

[3] Janssens S. Stem cells in the treatment of heart disease[J]. Annu Rev Med, 2010, 61: 287-300.

[4] Arminan A, Gandia C, Garcia-Verdugo JM, et al. Mesenchymal stem cells provide better results than hematopoietic precursors for the treatment of myocardial infarction [J]. J AM Coll Cardiol, 2010,55(20):2244-2253.

[5] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science, 1999， 284(5411):143-147.

[6] Giordano A, Galderisi U, Marino IR. From the laboratory bench to the patient’s bedside: an update on clinical trials with mesenchymal stem cells[J]. J Cell Physiol, 2007, 211(1):27-35.

[7] Hare JM,Traverse JH, Henry TD, et al. Arandomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction [J]. J AM Coll Cardiol, 2009, 54(24):2277-2286.

[8] Trachtenberg B, Velazquez DL, Williams AR, et al. Rationale and design of the transendocardial injection of autologous human cells (bone marrow or mesenchymal) in chronic ischemic left ventricular dysfunction and heart failure secondary to myocardial infarction (TAC-HFT) trial: a randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy[J]. Am Heart J, 2011,161(3): 487-493.

[9] Williams AR, Trachtenberg B, Velazquez DL, et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling[J]. Circ Res, 2011, 108(7):792-796.

[10] Samper E, Diez-Juan A, Montero JA, et al. Cardiac cell therapy: boosting mesenchymal stem cells effects[J]. Stem Cell Rev, 2013, 9(3):266-280.

[11] Mangi AA, Noiseux N, Kong D, et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts[J]. Nat Med, 2003, 9(9):1195-1201.

[12] Li W, Ma N, Ong LL, et al. Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function[J]. Stem Cells, 2007, 25(8):2118-2127.

[13] Fan L, Lin C, Zhuo S, et al. Transplantation with survivin-engineered mesenchymal stem cells results in better prognosis in a rat model of myocardial infarction[J]. Eur J Heart Fail, 2009, 11(11):1023-1030.

[14] Li XH, Fu YH, Lin QX, et al. Induced bone marrow mesenchymal stem cells improve cardiac performance of infarcted rat hearts[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(2):1333-1342.

[15] Shan Z, Lin Q, Deng C, et al. An efficient method to enhance gene silencing by using precursor microRNA designed small hairpin RNAs[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36(6):1483-1489.

[16] Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29(9):e45.

[17] Geng YJ. Molecular mechanisms for cardiovascular stem cell apoptosis and growth in the hearts with atherosclerotic coronary disease and ischemic heart failure[J]. Ann N Y Acad Sci, 2003,1010:687-697.

[18] Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart[J]. Circulation, 2002, 105(1):93-98.

[19] Hu X, Yu SP, Fraser JL, et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2008,135(4):799-808.

[20] Li JH, Zhang N, Wang JA. Improved antiapoptotic and anti-remodeling potency of bone marrow mesenchymal stem cells by anoxic preconditioning in diabetic cardiomyopathy[J]. J Endocrinol Invest, 2008, 31(2):103-110.

[21] Wang JA, He A, Hu X, et al. Anoxic preconditioning: a way to enhance the cardioprotection of mesenchymal stem cells[J]. Int J Cardiol, 2009, 133(3):410-412.

[22] Potier E, Ferreira E, Meunier A, et al. Prolonged hypoxia concomitant with serum deprivation induces massive human mesenchymal stem cell death[J]. Tissue Eng, 2007, 13(6):1325-1331.

[23] Zhu W, Chen J, Cong X, et al. Hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells[J]. Stem Cells, 2006, 24(2):416-425.

[24] 華 平,劉家良,楊淞然, 等.慢病毒介導的caspase-3沉默對大鼠骨髓間充質干細胞增殖和凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志,2013,29(8):1502-1507.