王俊巖，朱美林，冷 雪，馬佳會(huì)，楊 祎，邵楚茜，賈連群

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽(yáng) 110032)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。載脂蛋白E (apolipoprotein E, aopE)主要存在于極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)、乳糜微粒(chylomicrons，CM)和部分高密度脂蛋白 (high density lipoprotein receptor, HDL)中，參與甘油三酯(triglyceride，TG)和膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDL-R)途徑和非LDL-R途徑發(fā)揮降低血漿中TG、總膽固醇(total cholesterol, TC)水平的作用。AopE基因缺失小鼠，由于apoE依賴(lài)的LDL-R途徑和非LDL-R途徑受阻，導(dǎo)致TG、TC、LDL和 VLDL 水平升高進(jìn)而誘發(fā)AS發(fā)生[1-2]。

丹參酮ⅡA為唇形科植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根莖的主要脂溶性成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參酮ⅡA能抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，降低氧化低密度脂蛋白(LDL)的生成，能有效抑制AS形成[3]。本研究通過(guò)觀察丹參酮ⅡA對(duì)ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響及可能機(jī)制，為該類(lèi)藥物在臨床上通過(guò)降脂防治AS相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只ApoE-/-小鼠，6～8周齡，雌雄各半，體重18～20 g。同齡具有相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠10只。購(gòu)于北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為[SCXK(京)2011-0012]，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，自由飲水與攝食。

1.2 試劑與儀器 Trizol、RT-PCR試劑盒、瓊脂糖購(gòu)自大連TaKaRa公司；HE染色液購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司；兔抗小鼠LDL-R、LCAT單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；TG、TC、HDL-C、LDL-C測(cè)定試劑盒購(gòu)自四川邁新生物技術(shù)有限公司。丹參酮ⅡA購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。熒光顯微鏡，德國(guó)Leica；PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)；全自動(dòng)生化分析儀，日本東芝。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 20只ApoE-/-小鼠全程給予西方高脂膳食飼料(含脂肪21%，膽固醇0.15%)，飼喂8周后隨機(jī)分為模型組、丹參酮ⅡA組，每組10只。另外同齡具有相同遺傳背景的C57BL/6/J小鼠10只作為空白對(duì)照。各組按如下方式處理：①空白對(duì)照組：予普通顆粒小鼠飼料，同時(shí)給予等量蒸餾水灌胃。②模型組：予西方高脂膳食飼料，同時(shí)給予等量蒸餾水灌胃。③丹參酮ⅡA組：予西方高脂膳食飼料，每日灌服丹參酮ⅡA 30 mg / kg。灌胃給藥，每日1次，按照上述方法連續(xù)喂養(yǎng)8周取材。實(shí)驗(yàn)期間模型組ApoE-/-小鼠死亡2只，最終獲取有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的動(dòng)物為28只。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.2.1 血脂檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C含量。

2.2.2 肝臟病理組織形態(tài)學(xué)觀察 肝臟組織4%多聚甲醛溶液中固定24 h，按蘇木素-伊紅(HE)染色常規(guī)方法進(jìn)行70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(切片厚度為5 μm)、貼片、烤片后,用二甲苯脫蠟、70%～100%梯度酒精復(fù)水、蘇木精染色、70%鹽酸酒精分色、伊紅復(fù)染后,再用70%～100%梯度酒精脫水、二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片石蠟包埋，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。

2.2.3 油紅O染色觀察主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積 肝臟樣本制備冰凍切片(6 μm)，切片干燥后入50%乙醇水洗，油紅O染色8 min，50%乙醇分化，自來(lái)水終止分化，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水反藍(lán)，甘油明膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織脂質(zhì)沉積情況。

2.2.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 定量分析肝臟LDL-R、LCAT mRNA水平 引物由大連TaKaRa生物技術(shù)公司合成，選用β-actin作為內(nèi)參照(見(jiàn)表1)。100mg組織液氮研磨后加入1 mL Trizol裂解，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入0.2 mL氯仿，離心，吸取上層水相，加等量的異丙醇沉淀RNA，離心，緩慢加人75%乙醇洗滌，離心，空氣風(fēng)干后加入DEPC水溶解。紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm及280 nm OD值，計(jì)算RNA的濃度和純度同時(shí)電泳檢測(cè)。取0.5 μg RNA用于RT-PCR，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明操作，循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min 后4 ℃保存。各組取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在Gelpro32凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行分析，以各組目的基因條帶與β-actin條帶密度比值表示相應(yīng)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1引物序列表

引物上游引物下游引物長(zhǎng)度LDL-R5′-TCCATCTTCTTCCCTATTGC-3′5′-GCCCAGCTTTGCTCTTAT-3′358bpLCAT5′-GTCTTCCTCATTGGGCATAG-3′5′-AAAGTCTTGGACGGTGTAGTT-3′312bpβ-actin5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′302bp

2.2.5 Western bloting 法檢測(cè)肝臟LDL-R、LCAT蛋白表達(dá) 加入蛋白裂解液提取總蛋白， Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。60μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，加入1∶100兔抗小鼠 LDL-R、LCAT， 4℃封閉過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2000)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)混合發(fā)光液A和B，與膜作用5 min后進(jìn)行X光片曝光。X光片顯影和定影后觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 各組實(shí)驗(yàn)小鼠血脂變化比較(見(jiàn)表2) 與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平顯著升高(P<0.01)，HDL-C水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，丹參酮ⅡA組小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平顯著降低(P<0.01)，HDL-C水平顯著升高(P<0.01)。

組別TGTCLDL-CHDL-C 空白對(duì)照組1．01±0．032．21±0．120．18±0．030．95±0．08 模型組3．63±0．12??21．36±2．35??2．60±0．25??0．36±0．01?? 丹參酮ⅡA組2．03±0．30△13．35±0．58△△1．45±0．25△△0．71±0．01△△

注：與空白對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01。

3.2 各組實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟病理組織形態(tài)學(xué)改變(見(jiàn)圖1) 空白對(duì)照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小均勻，肝細(xì)胞索排列規(guī)整，肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，核圓、大、居中，核仁清晰可見(jiàn)。模型組小鼠肝細(xì)胞排列層次紊亂，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核變大界限不清，核仁消失，肝血竇變小、有充血，中央靜脈和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形現(xiàn)象明顯，細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量大小不等的圓形脂肪空泡和中性粒性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。丹參酮ⅡA組肝細(xì)胞排列層次較規(guī)則，形態(tài)結(jié)構(gòu)較清晰，肝細(xì)胞水腫減輕，中性粒性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。油紅O染色結(jié)果顯示模型組小鼠肝臟細(xì)胞中脂滴明顯增多，而丹參酮ⅡA組小鼠肝臟細(xì)胞中脂滴明顯減少。

注：A、D：空白對(duì)照組；B、E：模型組；C、F：丹參酮ⅡA組；A、B、C：(HE染色×200)；D、E、F：(油紅O染色×400)。圖1 各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變及油紅O染色結(jié)果

3.3 各組實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟LDL-R、LCAT mRNA表達(dá)(見(jiàn)圖2，3) 與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟LDL-R、LCAT mRNA水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，丹參酮ⅡA組小鼠肝臟LDL-R、LCAT mRNA水平顯著升高(P<0.01)。

注：1.空白對(duì)照組；2.模型組；3.丹參酮ⅡA組。 圖2 各組小鼠肝臟LDL-R、LCAT mRNA表達(dá)

注：1.空白對(duì)照組；2.模型組；3.丹參酮ⅡA組。 圖3 丹參酮ⅡA對(duì)小鼠肝臟LDL-R、LCAT mRNA表達(dá)的影響

3.4 各組實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟LDL-R、LCAT蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖4，5) Western bloting結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟LDL-R、LCAT蛋白水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，丹參酮ⅡA組小鼠肝臟LDL-R、LCAT蛋白水平顯著升高(P<0.01)。

注：1.空白對(duì)照組；2.模型組；3.丹參酮ⅡA組。 圖4 各組小鼠肝臟LDL-R、LCAT蛋白表達(dá)

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為AS發(fā)生常與身體虛弱加之血脈瘀阻、痰濁等有關(guān)，治療時(shí)當(dāng)以益氣健脾、活血祛瘀為要。丹參又名赤參，紫丹參，紅根等。為雙子葉植物唇形科，干燥根及根莖。具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，養(yǎng)血安神等作用。臨床中常應(yīng)用于治療胸痹、真心痛、瘀血等證。丹參酮ⅡA為丹參中主要脂溶性成分。本實(shí)驗(yàn)擬探討丹參酮ⅡA對(duì)ApoE-/-小鼠血脂、肝臟脂質(zhì)沉積的影響及其可能的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)選用的ApoE-/-小鼠由美國(guó)洛克菲勒大學(xué)生化遺傳與代謝實(shí)驗(yàn)室和北卡羅萊那大學(xué)病理遺傳實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用胚胎干細(xì)胞基因敲除(gene knockout)技術(shù)于1992年培育成功該種小鼠在飼喂普通飼料時(shí)即可產(chǎn)生血脂代謝異常而形成動(dòng)脈粥樣斑塊，在飼喂高脂(高脂肪、高膽固醇)飼料時(shí)，血脂明顯異常，斑塊形成明顯，病變程度較重。該種小鼠動(dòng)脈斑塊特點(diǎn)與人類(lèi)動(dòng)脈斑塊極其相似，是研究各類(lèi)藥物對(duì)肝臟脂類(lèi)代謝沉積影響的理想模型[4]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高；HDL- C水平顯著降低，肝臟油紅O染色顯示有大量脂滴沉積。以上結(jié)果表明本研究的動(dòng)物造模比較成功。對(duì)脂類(lèi)代謝相關(guān)基因研究表明，與正常組比較，模型組小鼠肝臟LDL-R、LCAT 基因表達(dá)顯著下調(diào)，提示ApoE-/-AS模型小鼠存在脂類(lèi)代謝相關(guān)基因表達(dá)紊亂。

血脂代謝異常造成肝內(nèi)脂質(zhì)沉積是造成動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素之一，脂類(lèi)沉積和細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集在AS形成過(guò)程中始終為主要因素。肝臟的LDL-R在機(jī)體脂蛋白代謝過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,血漿中膽固醇主要存在于LDL中,而65%～70%的LDL是依賴(lài)肝細(xì)胞LDL-R清除。肝臟LDL-R還影響LDL生成的速率[5-6]。LCAT催化HDL-C的膽固醇3位羥基接受卵磷脂2位?；篚セ赡懝檀减ィw內(nèi)絕大部分膽固醇經(jīng)過(guò)這一步驟后才能被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)一步分解代謝[7]。LCAT催化膽固醇酯化后引起廣泛的生理效應(yīng)，主要包括新生HDL向成熟大顆粒 HDL亞類(lèi)轉(zhuǎn)變、清除LDL和VLDL顆粒中過(guò)剩CE、促進(jìn)細(xì)胞膜上的膽固醇轉(zhuǎn)移至HDL等。LCAT結(jié)構(gòu)異常或表達(dá)減少導(dǎo)致膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，具有拮抗AS作用的HDL-C水平下降，外周組織以及LDL和VLDL中過(guò)剩的游離膽固醇水平升高，AS易感性增加[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比較，丹參酮ⅡA組小鼠血清TC、TG、LDL- C 水平顯著下降，HDL-C水平顯著升高，肝臟油紅O染色顯示肝臟內(nèi)脂滴數(shù)量明顯減少，表明肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減少，提示丹參酮ⅡA具有降低血脂減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積的作用。同時(shí)，與模型組比較，丹參酮ⅡA組小鼠肝臟LDL-R、LCAT 基因表達(dá)顯著上調(diào)，肝臟細(xì)胞對(duì)游離膽固醇攝取能力主要取決于膜表面LDL-R數(shù)量及其活性。結(jié)果表明丹參酮ⅡA增強(qiáng)了LDL-R基因的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞膜LDL-R數(shù)目增多，LDL-R活性升高，清除和轉(zhuǎn)移血中膽固醇等脂類(lèi)能力增強(qiáng)。LCAT表達(dá)增多，促進(jìn)了膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)以及其在肝臟的清除，從而一定程度上抑制AS發(fā)生發(fā)展[9]。綜上所述，丹參酮ⅡA具有減少ApoE-/-小鼠肝臟內(nèi)膽固醇等脂類(lèi)沉積的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控LDL-R和LCAT基因表達(dá)相關(guān)。

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