劉永萍， 彭 峰， 許昌聲， 柴大軍， 林金秀△

(福建醫(yī)科大學(xué) 1第一臨床醫(yī)學(xué)院，2附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建省高血壓研究所， 福建 福州 350005)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是目前世界上最常見的心血管死亡原因，其主要病理學(xué)基礎(chǔ)是冠狀動脈發(fā)生粥樣變化，而糖尿病是誘導(dǎo)動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年來的研究認(rèn)為，AS的發(fā)生與核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活性有關(guān)[1]。NF-κB是具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，經(jīng)高糖、低氧等刺激活化后參與調(diào)控多種細(xì)胞因子的生成，可引起平滑肌細(xì)胞由動脈中膜移行至內(nèi)膜并增殖，進(jìn)而觸發(fā)動脈粥樣斑塊的形成。有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充視黃醇X受體(retinol X receptor，RXR)激動劑或維生素D(vitamin D，VD)均可抑制NF-κB的激活[2-3]，由此我們推斷：NF-κB的激活受核受體RXR和維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)的調(diào)控。

RXR和VDR均屬于核受體超家族中的重要成員，能夠各自識別其特異性配體發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究發(fā)現(xiàn)RXR激動劑可抑制AS的進(jìn)展[4]；近年來的流行病學(xué)調(diào)查及臨床研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)維生素D的含量與AS的發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。本研究旨在觀察RXR激動劑貝沙羅汀(bexarotene，Bex)和VDR激動劑骨化三醇(calcitriol，Cal)對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除(STZ-ApoE-/-)小鼠胸主動脈粥樣硬化及NF-κB表達(dá)的調(diào)控，探討B(tài)ex和Cal抗動脈粥樣硬化的可能機(jī)制，為防治動脈粥樣硬化提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 動物和材料

8周齡ApoE-/-雄性小鼠(SPF級)，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，合格證號為SCXK(京)2011-0012。

STZ(Sigma)；Bex(Eisai)；Cal(羅蓋全;上海羅氏制藥有限公司)；β-actin單克隆抗體(Santa Cruz)；NF-κB單克隆抗體(Cell Signaling)；HRP標(biāo)記Ⅱ抗(Abcam)；免疫組化Ⅱ抗(北京中杉)。PVDF膜(Millipore)；低溫冰箱(日本三洋)；超速低溫離心機(jī)(AllegraTM64R，Beckman)；垂直電泳槽(Bio-Rad)；DYY-III-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)；蛋白轉(zhuǎn)移設(shè)備(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1糖尿病模型的建立[7]70只小鼠(10只C57BL/6，60只ApoE-/-)，體重22～24 g，普通飼料喂養(yǎng)在福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，50只ApoE-/-小鼠禁食12 h，腹腔注射STZ 150 mg/kg，連續(xù)2 d，(STZ配制：pH 4.4枸櫞酸緩沖液10 mL加100 mg STZ充分溶解即成STZ溶液，濃度為10 g/L，腹腔注射STZ前動物禁食12 h，注射量為0.1 mL/10 g體重)，注射STZ后給予自由飲水取食，3 d后，測空腹血糖≥11.2 mmol/L的ApoE-/-小鼠用于實(shí)驗(yàn)(共48只)。

2.2動物分組與取材 實(shí)驗(yàn)分6組：C57組、ApoE-/-組、STZ-ApoE-/-(糖尿病，diabetes mellitus,DM)組、STZ-ApoE-/-+Bex(10 mg·kg-1·d-1)組(Bex組)、STZ-ApoE-/-+Cal(10 μg/kg，每周2次)[8]組(Cal組)、STZ-ApoE-/-+Bex(10 mg·kg-1·d-1)+Cal(10 μg/kg,每周2次)組(Bex+Cal組)。連續(xù)灌胃12周，對照組給予同量生理鹽水灌胃。用藥12周后：小鼠眼底靜脈取血約2 mL，隨后立即行胸腹部切開，取胸主動脈于PBS漂洗，去除血跡及血管周圍結(jié)締組織，液氮凍存。

2.3Western blotting檢測小鼠胸主動脈NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 取胸主動脈50 mg于0.5 mL懸浮緩沖液[0.1 mol/L NaCl,0.01 mol/L Tris·HCl (pH 7.6)，0.001 mol/L EDTA (pH 8.0)，1 mg/L aprotinin,100 mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF),200 μmol/L DTT(aprotinin和PMSF及DTT臨用前加入)]，勻漿，加入等體積的2×SDS，劇烈振蕩并于-80 ℃冰箱凍融2次，放入水浴鍋中100 ℃煮10 min，4 ℃ 12 000×g離心10 min，取上清分裝，放入-80 ℃冰箱備用；經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育、顯影。Image 6.0成像分析系統(tǒng)分析。

2.4免疫組化法觀察小鼠胸主動脈NF-κB p65的分布及表達(dá)水平 取胸主動脈于PBS漂洗，去除血跡及血管周圍結(jié)締組織，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS浸泡5 min×3次，加入NF-κB單克隆抗體，4 ℃過夜。PBS沖洗，加適量組化Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗后，DAB顯色2～5 min，自來水沖洗，蘇木素染色，70%、85%、95%乙醇梯度脫水，烤片機(jī)烤干，中性樹脂封片。Image 6.0成像分析系統(tǒng)分析。

2.5蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)步驟 取胸主動脈于PBS漂洗，去除血跡及血管周圍結(jié)締組織，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋切片常規(guī)脫蠟，蘇木素染色，水洗復(fù)染，70%、85%、95%乙醇梯度脫水，1%伊紅乙醇染色，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察斑塊面積并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，各組兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

用藥12周后，C57組及ApoE-/-組小鼠精神佳，皮毛光亮順滑，活動量大，墊料干燥。STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠均為精神萎靡，毛發(fā)稀疏凌亂，體重偏低，墊料較濕。DM組及Cal組因眼睛潰爛各死亡1只，Bex組左上肢癱瘓1只，各組均有不同程度的頰部膿腫形成，考慮是糖尿病的并發(fā)癥。

1 各組小鼠空腹血糖的比較

與C57組相比，ApoE-/-組的血糖水平無明顯變化，DM組的血糖明顯增高(P<0.05)；Bex和Cal對STZ-ApoE-/-小鼠的血糖無顯著影響，見表1。

2 各組小鼠血脂的比較

與C57組相比，ApoE-/-組血清低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、總膽固醇(total cholesterol,TC)及甘油三酯(triglyceride,TG)水平升高(P<0.05)；與ApoE-/-組相比，DM組的血清LDL和TC進(jìn)一步升高(P<0.05)，Bex和Cal對STZ-ApoE-/-小鼠的血清LDL、TC及TG無顯著影響，Bex可升高血清高密度脂蛋白水平，見表1。

表1 各組小鼠空腹血糖、血脂水平的比較

3 Bex和Cal對NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

與C57組相比，ApoE-/-組和DM組的NF-κB p65蛋白水平增加(0.07±0.01vs0.84±0.09、0.86±0.10，P<0.05)；與DM組相比，Bex組和Cal組的NF-κB p65蛋白減少(0.86±0.10vs0.67±0.01、0.65±0.10,P<0.05)，Bex+Cal組的NF-κB p65蛋白水平減少更顯著(0.86±0.10vs0.10±0.02,P<0.01),見圖1。

4 免疫組化法觀察Bex和Cal對小鼠主動脈內(nèi)皮NF-κB p65分布的影響

染色結(jié)果出現(xiàn)棕色為NF-κB p65陽性。C57組小鼠的主動脈內(nèi)膜下未見明顯棕色沉淀，ApoE-/-組主動脈斑塊處可見少許細(xì)胞漿棕染。與ApoE-/-組相比，DM組的NF-κB p65在細(xì)胞核分布明顯增多(3 557.46±729.60vs11 500.49±1 415.49,P<0.01)；與DM組相比，Bex組和Cal組的NF-κB p65減少(11 500.49±1 415.49vs4 755.55±578.88、5 416.21±767.90，P<0.05)，Bex+Cal組減少更明顯(11 500.49±1 415.49vs2 770.86±981.76，P<0.01)，見圖2。

Figure 1. Effect of Bex and Cal on the protein expression of NF-κB p65. Mean±SD.n=3.△P<0.05 vs C57; ▲P<0.05 vs DM；■P<0.05 vs Cal.

Figure 2. Effect of Bex and Cal on the distribution of NF-κB p65 in the thoracic aorta.Scale bar=200 μm. Black arrows indicate positive staining, while red arrows indicate non-specific staining. Mean±SD.n=5.△P<0.05 vs ApoE-/-; ▲P<0.05 vs DM; ★P<0.05 vs Bex.

5 Bex和Cal對STZ誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠胸主動脈斑塊的影響

C57組小鼠的主動脈內(nèi)膜光滑完整，未見到脂質(zhì)斑塊形成；ApoE-/-組可見內(nèi)膜粗糙及脂質(zhì)小斑塊形成；DM組和Cal組的血管內(nèi)膜不規(guī)則，管腔變小且形成巨大脂質(zhì)斑塊，斑塊下方有脂質(zhì)空洞形成，Bex組內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊減小，形成薄而均勻的脂質(zhì)外層；B+C組內(nèi)膜脂質(zhì)斑塊顯著減小。斑塊面積分析：與ApoE-/-組相比，DM組的斑塊面積顯著增高(P<0.01)；Bex和Cal可降低STZ-ApoE-/-小鼠的胸主動脈斑塊面積，聯(lián)合用藥組的斑塊面積減少更顯著(P<0.01),見圖3。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，RXR激動劑Bex和VDR激動劑Cal對STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠血糖、血脂水平無影響，但可抑制其胸主動脈NF-κB的激活、減小其斑塊面積。

對于AS的研究，既往認(rèn)為控制血糖血脂是預(yù)防AS發(fā)生的關(guān)鍵[9]。近年來提出內(nèi)皮學(xué)說即AS的發(fā)病機(jī)制涉及血管內(nèi)皮的損傷、炎細(xì)胞的聚集、脂質(zhì)的沉積、平滑肌細(xì)胞的增生遷移等多種因素，并指出AS的發(fā)展與NF-κB的異常激活有關(guān)[1]。NF-κB是一種多效性的轉(zhuǎn)錄因子。在糖尿病環(huán)境下，血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB異常活化，調(diào)控多種細(xì)胞因子如細(xì)胞間黏附因子、血管細(xì)胞黏附因子、E選擇素等生成增多[2]；同時(shí)，NF-κB激活后可抑制細(xì)胞的凋亡，引起血管平滑肌細(xì)胞的反應(yīng)性增生及纖維化，進(jìn)而促使動脈粥樣斑塊形成。我們在研究中同樣發(fā)現(xiàn)，AS的發(fā)展與NF-κB的激活密切相關(guān)。有研究報(bào)道高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白的表達(dá)明顯增多[2]。徐雷等[10]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠體內(nèi)NF-κB表達(dá)明顯增多，Watson等[11]也發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠體內(nèi)NF-κB p65表達(dá)明顯增多、主動脈斑塊面積明顯增大，與我們的研究結(jié)果一致。

Figure 3. The effect of Bex and Cal on the thoracic artery plaque area (HE staining, scale bar=100 μm).Mean±SD.n=10.△P<0.05 vs C57; □P<0.05 vs ApoE-/-; ▲P<0.05 vs DM; ★P<0.05 vs Bex.

RXR和VDR同是核受體超家族的成員，屬于配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子，即需與其特異性配體(RXR激動劑、維生素D3)結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。有研究報(bào)道RXR激動劑能顯著降低高糖所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞核中NF-κB p65的蛋白水平[2]，Claudel等[12]也提出RXR激活能延緩ApoE-/-小鼠AS的進(jìn)展。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，Bex能抑制STZ-ApoE-/-小鼠胸主動脈NF-κB p65的激活及減小斑塊面積。

近幾年的流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究均顯示，維生素D的缺乏與心血管疾病的危險(xiǎn)因素有著密切的聯(lián)系，補(bǔ)充維生素D3可以降低2型糖尿病患者冠心病的發(fā)病率[5]。Tukaj等[3]認(rèn)為補(bǔ)充維生素D3可增加血管平滑肌細(xì)胞中抑制蛋白IκB (IκBα)的蛋白表達(dá)。大量動物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，維生素D和VDR缺失更容易出現(xiàn)平滑肌細(xì)胞的增殖及動脈硬化斑塊的形成[13-14]，補(bǔ)充適量的VD可以延緩AS的發(fā)生[8]。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)Cal可抑制STZ-ApoE-/-小鼠胸主動脈NF-κB的激活及減小AS的斑塊面積。本研究還發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用Bex和Cal抑制NF-κB的活性及抗AS作用更顯著。

RXR作為核受體超家族的重要成員，可優(yōu)先與不同配體介導(dǎo)的受體(如VDR、LXRs、PPARs、FXR等)以高親和力形成異源二聚體，亦可形成同源二聚體，參與多種基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。隨著研究的進(jìn)展，有報(bào)道稱單獨(dú)給予維生素D3或9-順式維甲酸均不能抑制異源二聚體VDR-RXR靶基因的表達(dá)，而二者聯(lián)合有協(xié)同作用[15]。由此我們推測，單獨(dú)補(bǔ)充Bex或Cal可能是通過形成同源二聚體RXR-RXR或VDR-VDR發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而聯(lián)用Bex或Cal則形成異源二聚體VDR-RXR發(fā)揮協(xié)同作用，調(diào)節(jié)STZ-ApoE-/-小鼠胸主動脈NF-κB的活性及發(fā)揮抗AS作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Bex或Cal在對STZ誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠血糖血脂水平無顯著影響的情況下，可能是通過與受體RXR、VDR結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，抑制小鼠胸主動脈NF-κB的激活，減少脂質(zhì)斑塊面積的形成，最終發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] 周曉慧，牛成偉，曹 凱，等.丹皮酚通過抑制NF-κB信號通路下調(diào)高脂血清誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)[J]. 中國病理生理雜志，2011, 27(2):249-253.

[2] 柴大軍，林金秀，許昌聲，等.視黃醇類X受體激動劑抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[J].中華高血壓雜志, 2009, 17(11):1010-1014.

[3] Tukaj S, Trzonkowski P, Tukaj C. Regulatory effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3on vascular smooth muscle cells[J].Acta Biochim Pol, 2012, 59(3):395-400.

[4] Lalloyer F, Fiévet C, Lestavel S,et al. The RXR agonist bexarotene improves cholesterol homeostasis and inhibits atherosclerosis progression in a mouse model of mixed dyslipidemia[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(12):2731-2737.

[5] 姚 維，張振建，錢 進(jìn)，等.血清25-羥維生素D濃度與2型糖尿病并發(fā)冠心病的關(guān)系[J]. 臨床薈萃，2013, 28(1):7-10.

[6] van de Luijtgaarden KM,Vote MT, Hoeks SE,et al. Vitamin D deficiency may be an independent risk factor for arterial disease[J].Eur J Vasc Endovasc Sur, 2012, 44(3):301-306.

[7] Dekel Y, Glucksam Y, Elron-Gross I，et al. Insights into modeling streptozotocin induced diabetes in ICR mice[J]. Lab Animal, 2009, 38(2):55-60.

[8] Takeda M，Yamashita T，Sasaki N，et al. Oral administration of an active form of vitamin D3(calcitriol) decreases atherosclerosis in mice by inducing regulatory T cells and immature dendritic cells with tolerogenic functions[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010, 30(12):2495-2503.

[9] UK Prospective Diabetes Study Group.Tight blood pressure control and risk of macrovascular and microvasccular complications in type 2 diabetes: UKPDS 38[J].BMJ, 1998, 317(7160):703-713.

[10] 徐 雷，馮 波，王 華，等.抗氧化劑α-硫辛酸對2型糖尿病大鼠動脈組織NF-κB表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志,2007, 23(12):2474-2475,2493.

[11] Watson AM,Li J, Schumacher C, et al. The endothelin receptor antagonist avosentan ameliorates nephropathy and atherosclerosis in diabetic apolipoprotein E knockout mice[J]. Diabetologia, 2010, 53(1):192-203.

[12] Claudel T, Leibowitz MD, Fiévet C, et al. Reduction of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice by activation of the retinoid X receptor[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(5):2610-2615.

[13] Ish-shalom M, Sack J, Vechoropoulos M, et al. Low-dose calcitriol decreases aortic renin, blood pressure, and atherosclerosis inApoE-null mice[J]. J Atheroscler Thromb, 2012, 19(5):422-434.

[14] Szeto FL, Reardon CA, Yoon D, et al. Vitamin D receptor signaling inhibits atherosclerosis in mice[J]. Mol Endocrinol, 2012, 26(7):1091-1101.

[15] Dave VP, Kaul D, Sharma M. Crosstalk between RXR,LXR and VDR within blood mononuclear cellular model[J].Indian J Exp Biol,2012,50(1):35-40.