于 楊, 馮玉梅, 郭守東, 崔英杰, 宋國華, 馮 蕾, 羅 甜, 陳 超, 王義維, 蔣憲成, 秦樹存△

(1山東省高校動脈粥樣硬化重點(diǎn)實驗室,泰山醫(yī)學(xué)院動脈粥樣硬化研究所,山東 泰安 271000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,河北 承德 067000； 3紐約州立大學(xué)下州醫(yī)學(xué)中心解剖學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)系，美國 紐約 11203)

心腦血管疾病是現(xiàn)代社會人類的頭號殺手，其主要病理學(xué)基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)是體內(nèi)最重要的抗AS因素[1]。時至今日，越來越多的研究人員證明HDL的水平與其功能幾乎同等重要，對AS的發(fā)生發(fā)展意義重大[1-2]。HDL顆粒成分中，載脂蛋白、酶類和某些重要脂質(zhì)分子在內(nèi)的物質(zhì)對HDL的抗AS功能至關(guān)重要。

生理狀態(tài)下，超過50%的血漿脂質(zhì)信號分子鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)富集于HDL上，并可通過其特異性受體發(fā)揮動脈保護(hù)作用[3]。紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和肥大細(xì)胞等均能釋放S1P入血液循環(huán)[4]。HDL通過S1P特異性載體載脂蛋白M(apolipoprotein M，apoM)將S1P富集[5]。然而，S1P如何從細(xì)胞到HDL上的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制目前仍不明確，其分布與血漿蛋白的關(guān)系及其機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明。

磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)是一種多功能蛋白，廣泛表達(dá)于肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等。PLTP能介導(dǎo)磷脂、游離膽固醇及其它雙性脂質(zhì)分子從富含甘油三酯(triglyceride, TG)的脂蛋白顆粒向HDL轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。在冠心病患者，血漿HDL水平下降同時伴有PLTP活性增高[7]。另外，冠心病及心肌梗塞患者非HDL(non-HDL)上S1P明顯增加，提示血漿脂蛋白上S1P水平及分布與動脈粥樣硬化性疾病嚴(yán)重程度關(guān)系密切[8]。S1P是鞘氨醇的磷酸化產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其它能夠被PLTP轉(zhuǎn)運(yùn)的雙性脂質(zhì)分子相似，這提示PLTP很有可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)S1P的作用，并通過該機(jī)制改變S1P在HDL和其它脂蛋白上的含量和分布。本研究結(jié)果表明，PLTP過表達(dá)情況下，能夠顯著降低HDL上S1P的同時升高低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)上S1P，其機(jī)制可能與PLTP介導(dǎo)S1P的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 動物

PLTP轉(zhuǎn)基因小鼠(PLTPtransgenic mouse，PLTP-Tg)和PLTP敲除小鼠(PLTP-/-)由蔣憲成博士贈予。本研究中所用PLTP-Tg、PLTP-/-及野生型(wild-type，WT)小鼠的遺傳背景均為C57BL/6并經(jīng)過9代回交。喂養(yǎng)小鼠的標(biāo)準(zhǔn)飼料購自北京維通利華公司，自由飲水。所有實驗動物均喂養(yǎng)于溫濕度可控、12/12 h亮暗循環(huán)的房間內(nèi)。本實驗經(jīng)過泰山醫(yī)學(xué)院動物關(guān)懷委員會認(rèn)證，所有動物實驗均按照《泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物關(guān)懷與使用指南》進(jìn)行。

2 抗體和材料

apoM抗體購自Cell Signaling Technology。完全蛋白酶抑制劑混合片劑購自Roche。D-erythro-S1P、離心分離柱 (截流分子量≤3 kD)、分析純甲酸和甲酸銨購自Sigma-Aldrich。內(nèi)標(biāo)D-erythro-C17-鞘氨醇-1-磷酸(C17-S1P)購自Avanti Polar Lipids Inc.。甲醇和乙醇購自SK Chemicals。脂質(zhì)定量試劑盒購自中生北控公司。蛋白定量試劑盒、透析膜(截流分子量≤ 8 kD)和D-Hanks緩沖液購自Solarbio。

3 血漿分離和脂蛋白制備

第10～11周齡時，禁食后取材，分離WT或PLTP-Tg血漿0.6 mL后進(jìn)行超速離心以分離脂蛋白[9]。

4 S1P相關(guān)檢測

4.1制備S1P標(biāo)準(zhǔn)品 S1P標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.1 g/L溶于乙醇后，即分裝，并儲存于-20 ℃。通過稀釋獲得系列工作液濃度為50～1 000 g/L。

4.2生物樣本制備和脂質(zhì)提取 20 μL血漿樣本與10 μL內(nèi)標(biāo)C17-S1P (400 μg/L)與甲醇充分混合后，超聲10 min，11 000×g離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中進(jìn)行S1P定量檢測。用10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(400 mg/L)和甲醇校正標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，此刻內(nèi)標(biāo)C17-S1P濃度為40 mg/L。

4.3串聯(lián)質(zhì)譜分析 Waters Symmetry? 碳18柱(3.5 μm, 2.1 mm 內(nèi)徑×10 mm)色析法線性洗脫(3.5 μm, 2.1 mm 內(nèi)徑×100 mm) 后，流動相成分為2 mol/L 甲酸銨、0.1%甲酸溶解于90%甲醇。上樣體積為5 μL，流速為0.2 mL/min。采用陽離子模式操作質(zhì)譜儀器， 離子噴嘴電壓為5 500V，溫度為550 ℃，輔助氣壓力為55 psi。 噴霧氣壓力55 psi, 氣幕壓力10 psi，碰撞氣壓為中等。S1P (碰撞能量29.0 V)離子躍遷產(chǎn)物前體m/z 380.2→264.1，C17-S1P (碰撞能量19.9V) 離子躍遷產(chǎn)物前體 m/z 用于在液質(zhì)聯(lián)用-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)多反應(yīng)模式(multiple response model，MRM)下定量，保留時間100 ms。采用Analyst Software 1.6定量分析。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線上S1P標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品濃度以及S1P峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值最終計算出樣本中S1P濃度。

4.4S1P轉(zhuǎn)運(yùn)實驗 為明確PLTP轉(zhuǎn)運(yùn)S1P的作用，本研究采用一種供體-接受體轉(zhuǎn)運(yùn)體系。首先，新鮮分離的PLTP-/-紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)經(jīng)冰冷的D-Hanks緩沖液重懸后，600×g4 ℃離心5 min, 棄上清。重復(fù)洗滌1次以除去殘存血漿。RBC懸液細(xì)胞密度調(diào)整至1010～1011/L，該溶液作為S1P供體，平均S1P含量為(900.67±6.68) ng/L。參照Yoshino方法制備重組HDL作為S1P接受體。取自PLTP-/-和WT新鮮血漿分別作為轉(zhuǎn)運(yùn)實驗的陰性對照或PLTP來源。D-Hanks緩沖液作為轉(zhuǎn)運(yùn)實驗的空白對照。20 μL的供體、50 μL接受體和2 μL 含PLTP的WT血漿或PLTP-/-血漿或D-Hanks液在Eppendorf管內(nèi)輕柔混合，并用D-Hanks液調(diào)整體積至100 μL。轉(zhuǎn)運(yùn)實驗混合物在37 ℃孵育60 min，孵育后300×g4 ℃離心2 min分離上清HDL和RBC沉淀。分別檢測上清中和沉淀內(nèi)S1P含量。為明確轉(zhuǎn)運(yùn)實驗中S1P以何種形式存在，本研究采用離心分離柱(截流分子量≤ 3 kD)將轉(zhuǎn)運(yùn)實驗結(jié)束后的上清進(jìn)行處理。結(jié)果表明分子量<3 kD的流出液中并未檢測到S1P。這證明本系統(tǒng)中S1P基本以結(jié)合型存在。

5 蛋白分離、電泳及免疫印跡

參照文獻(xiàn)[10]每孔2 μg血漿或脂蛋白樣本加入十二烷基硫酸鈉凝膠中進(jìn)行電泳和免疫印跡檢測apoM含量，采用Image-Pro Plus 6.0分析。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2 組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PLTP過表達(dá)降低血漿S1P含量

收集PLTP-Tg與WT小鼠血漿后檢測血脂和S1P含量。血漿脂質(zhì)水平見表1。可見PLTP-Tg小鼠血漿總膽固醇(total cholesterol, TC)、HDL膽固醇(HDL cholesterol, HDL-C)和非HDL膽固醇(non-HDL-C)均顯著低于WT小鼠。如圖1A所示，PLTP-Tg小鼠血漿S1P含量顯著低于WT小鼠。由于血漿中超過60%的S1P富集于脂蛋白上，脂蛋白上脂質(zhì)含量變化可能對血漿S1P產(chǎn)生影響，所以將血漿S1P含量采用TC進(jìn)行校正。結(jié)果表明,經(jīng)過TC校正后，PLTP-Tg小鼠血漿S1P含量顯著高于WT，見圖1B。這說明PLTP對血漿S1P含量和分布有顯著影響。

表1 血漿脂質(zhì)含量

Figure 1. Plasma S1P content (A) and total cholesterol (TC)-normalized plasma S1P content (B) in PLTP-Tg mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs WT group.

2 PLTP過表達(dá)顯著升高LDL上S1P比例

如圖2所示，PLTP-Tg小鼠HDL和極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)上S1P含量較WT小鼠明顯減少，而LDL上S1P則顯著增加127.4%，提示過表達(dá)PLTP很可能促進(jìn)LDL上S1P含量的增加。

3 PLTP從紅細(xì)胞將S1P轉(zhuǎn)運(yùn)至重組脂質(zhì)體

如圖3所示，與不含PLTP的血漿相比，WT血漿能夠增加重組脂質(zhì)體上S1P含量超過350%，說明PLTP能夠?qū)1P轉(zhuǎn)運(yùn)至重組脂質(zhì)體。

Figure 2. S1P content in lipoprotein was affected by PLTP overexpression.A～C: S1P content in HDL,LDL and VLDL, respectively; D: S1P distribution. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01 vs WT group.

Figure 3. PLTP transferred S1P from RBC to recombinant liposome.Mean±SD.n=4.**P<0.01 vs blank; △△P<0.01 vs negative control.

4 PLTP過表達(dá)不影響血漿apoM含量

如圖4A和B所示，PLTP-Tq與WT小鼠比較，apoM含量無論是血漿中還是HDL組分中均無明顯差別。圖4C顯示,PLTP過表達(dá)不影響血漿中和脂蛋白上apoM的含量和分布。

討 論

S1P是HDL上與血管保護(hù)作用有關(guān)的重要信號分子[5]。在動脈粥樣硬化性疾病時S1P在脂蛋白上分布有明顯變化[8]。為闡明該機(jī)制，我們開展如下研究并首次發(fā)現(xiàn)：(1)PLTP過表達(dá)能升高經(jīng)膽固醇校正后血漿S1P含量；(2)血漿中高水平PLTP能顯著增加LDL組分中S1P含量；(3)其機(jī)制與PLTP能夠介導(dǎo)S1P從細(xì)胞向脂蛋白類顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)這一機(jī)制有關(guān)；(4)血漿apoM含量與PLTP表達(dá)無關(guān)。

由于S1P在HDL上和非HDL上表現(xiàn)出相反的作用，提示S1P在HDL與非HDL上的分布變化可能是AS性疾病的重要致病因素。因此明確血漿S1P分布對于研究冠心病和中風(fēng)等AS性疾病的發(fā)病機(jī)制有重要意義。血漿中S1P的主要載體是HDL，HDL-S1P具有增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用和促進(jìn)內(nèi)皮源性一氧化氮分泌等作用，也是HDL動脈保護(hù)功能的重要組成部分[5]。因此，血漿S1P的含量和分布對于HDL功能有重要意義。本研究結(jié)果表明參與HDL代謝的酶或蛋白能夠改變S1P分布，并參與AS性疾病的發(fā)生發(fā)展。

Figure 4. ApoM content in plasma and lipoprotein was not affec-ted by PLTP overexpression in mice. A: plasma apoM content in PLTP-Tg and WT mice; B: HDL apoM content in PLTP-Tg and WT mice; C: apoM content in non-HDL (combined VLDL and LDL) and HDL from PLTP-Tg or WT mice. Mean±SD.n=3.

PLTP屬于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族并能介導(dǎo)脂蛋白和細(xì)胞間雙性分子的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。PLTP-Tg小鼠血漿TC和HDL-C顯著下降提示其脂蛋白顆粒上蛋白和脂質(zhì)含量均發(fā)生明顯變化。PLTP過表達(dá)可加重載脂蛋白E敲除鼠AS進(jìn)程，而PLTP缺乏能減輕多種AS模型的斑塊形成，提示PLTP與AS的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[6]。然而關(guān)于PLTP表達(dá)水平對血漿S1P的含量和作用的影響尚無報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)PLTP過表達(dá)能降低血漿和HDL上S1P的含量，提示PLTP對維持HDL上S1P含量有重要作用。除此之外，本團(tuán)隊即將發(fā)表的數(shù)據(jù)表明PLTP能夠促進(jìn)S1P從紅細(xì)胞向HDL轉(zhuǎn)移，在此基礎(chǔ)上，本研究采用重組脂質(zhì)體作為S1P接受體，進(jìn)一步證實PLTP有助于S1P從紅細(xì)胞向脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移這一重要作用。

PLTP能夠介導(dǎo)諸如磷脂、維生素E等一些類型的脂質(zhì)分子以“脂蛋白到脂蛋白”或“細(xì)胞到脂蛋白”等形式的轉(zhuǎn)移[11]。PLTP的結(jié)構(gòu)與功能研究表明其能夠轉(zhuǎn)運(yùn)的分子均屬于雙性分子，兩端分別帶有親水和疏水基團(tuán)。S1P屬于鞘氨醇的磷酸化產(chǎn)物，亦屬于雙性分子，具有與其它能夠被PLTP轉(zhuǎn)運(yùn)的分子相似的結(jié)構(gòu)。因此本研究采用紅細(xì)胞作為S1P供體，重組脂質(zhì)體作為S1P接受體，檢測PLTP轉(zhuǎn)運(yùn)S1P的作用。該方法采用的轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖體系與廣泛報道的PLTP活性檢測采用的“供體-接受體”系統(tǒng)相同[7]。本研究發(fā)現(xiàn)PLTP能夠介導(dǎo)S1P自紅細(xì)胞向脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)，這一結(jié)果闡明了PLTP過表達(dá)通過其直接轉(zhuǎn)運(yùn)S1P的作用影響S1P含量和分布。

另一個影響HDL上S1P含量的決定性因素是S1P的內(nèi)源性特異載體apoM，apoM主要富集于HDL[5, 12]。在LDL受體敲除鼠和apoE敲除鼠體內(nèi)，apoM可發(fā)生從HDL向非HDL遷移的現(xiàn)象[12]。而本研究結(jié)果表明，PLTP過表達(dá)不影響小鼠血漿apoM含量，也未造成apoM從HDL上向其它脂蛋白的遷移。這從另一角度證明與其它基因修飾小鼠不同，PLTP過表達(dá)升高LDL上S1P含量的機(jī)制與向non-HDL上轉(zhuǎn)運(yùn)游離S1P有關(guān)，而不是通過影響apoM分布產(chǎn)生的間接作用。

LDL除了能通過結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF) -細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK) 1/2-c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)途徑反式激活S1P受體外，還具有很強(qiáng)的S1P結(jié)合能力，該能力與apoM無關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果表明在非HDL上檢測不到apoM，提示LDL可能通過某種未知機(jī)制俘獲S1P。另外，HDL能增加基礎(chǔ)水平上心肌灌流，而S1P則可通過S1P3受體抑制該機(jī)制，說明S1P活性與HDL的生物學(xué)效應(yīng)并非始終保持一致，這可能與S1P的受體分布和轉(zhuǎn)運(yùn)形式有關(guān)[12-13]。心梗及穩(wěn)定性心絞痛等AS性疾病患者非HDL上S1P含量增加提示該現(xiàn)象很可能與上述疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。同時冠心病等患者血漿PLTP活性明顯高于正常人群，那PLTP是否通過影響S1P的分布對AS性疾病產(chǎn)生影響，有待于進(jìn)一步研究[13]。

綜上所述，本研究進(jìn)一步明確了PLTP在血漿脂蛋白上S1P分布的作用，其機(jī)制與PLTP直接轉(zhuǎn)運(yùn)S1P有關(guān)。該結(jié)果為PLTP參與AS性疾病的病理生理機(jī)制提供了新的實驗依據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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