王林洋，王成祥，李 杰

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700)

本課題在借鑒國(guó)內(nèi)外對(duì)氨溴索(ambroxol)研究方法的基礎(chǔ)上[1-3]，以西藥氨溴索和中藥化痰方二陳湯為對(duì)照，觀察以清熱化痰法指導(dǎo)下的蔞芩止嗽煎對(duì)AECOPD痰熱證大鼠肺組織、血清及灌洗液中青霉素藥物濃度的影響，即對(duì)抗生素增效作用的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

Wistar雄性大鼠130只，體質(zhì)量(200±20) g，合格證號(hào)SCXK(京)2009-0007，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。內(nèi)毒素(L2880,由美國(guó)Sigma-Aldrich公司提供)；青霉素(華北制藥有限公司生產(chǎn))；金黃色葡萄球菌(北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)病原學(xué)與免疫實(shí)驗(yàn)室提供)；哈德門(mén)香煙(焦油含量12 mg，煙堿含量1.2 mg，由上海卷煙廠生產(chǎn))；氨溴索(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司)；甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司)；乙酸(分析純，美國(guó)Fisher Scientific公司)；青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；5 mol/L氫氧化鈉；0.15 mol/L磷酸二氫鈉水溶液。二陳湯方和蔞芩止嗽煎制備成免煎顆粒，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6490串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)，渦旋混合儀(Scientific Industries公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Avanti J-26 XPI離心機(jī)(Beckman Coulter公司)，Sigma 2-16 KL臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；分析天平(梅特勒AG245，最小精度0.1 mg)；Oasis RHLB 30 μm固相萃取小柱(6 cc/150 mg，3 cc/60 mg，美國(guó)Waters公司)，0.2 μm GHP濾膜(美國(guó)PALL公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及用藥 用熏吸香煙加氣管內(nèi)注射內(nèi)毒素的方法[4]建立大鼠COPD模型,分別于實(shí)驗(yàn)第7、14、28天向氣管內(nèi)注入溶于注射用生理鹽水的內(nèi)毒素200 μL(1 g/L)。第1～28天(第7、14、28天除外)上午將大鼠置入自制密閉的有機(jī)玻璃倉(cāng)(30 cm×45 cm×50 cm)內(nèi)，注入濃度約5%(V/V)哈德門(mén)香煙煙霧30 min/d，制備COPD大鼠模型。在COPD模型基礎(chǔ)上，參照李建生[5]AECOPD痰熱證模型建立方法，于第29天開(kāi)始連續(xù)9 d置于溫度(38±1) ℃、相對(duì)濕度50%、風(fēng)速0.7 m/s的鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行風(fēng)熱刺激，2次/d，每次30 min，建立痰熱證模型,并于第38天經(jīng)鼻腔注入金黃色葡萄球菌2.4×109cfu/mL)，2次/d，每次0.3 mL，連續(xù)滴注細(xì)菌3 d，制備AECOPD大鼠模型。模型制備后大鼠隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組、氨溴索組、二陳湯組和蔞芩止嗽煎組，每組各20只。每組分別予股四頭肌肌內(nèi)注射青霉素16萬(wàn)u/(kg·d)(與人體肌注量等效)，連續(xù)7 d；同時(shí)對(duì)照組予蒸餾水10 mL/(kg·d)灌胃，氨溴索組腹腔內(nèi)注射氨溴索6 mg/(kg·d)，二陳湯組予二陳湯10 mL/(kg·d)(制備成免煎顆粒，每克生藥配成3 mL混懸液)灌胃，蔞芩止嗽煎組予蔞芩止嗽煎劑10 mL/(kg·d)(制備成免煎顆粒，每克生藥配成3 mL混懸液)灌胃。上述給藥均每天2次。

2.2 采集生物標(biāo)本 從造模后開(kāi)始用藥計(jì)算,分別于第8天肌注青霉素后15、30 min，每組隨機(jī)處置動(dòng)物各10只,留取動(dòng)物標(biāo)本,檢測(cè)各組大鼠不同時(shí)段生物標(biāo)本中青霉素的濃度。

2.2.1 血清 以3.5%水合氯醛0.1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血6 mL。

2.2.2 支氣管肺泡灌洗液 麻醉大鼠仰臥固定于操作臺(tái)上，放血處死大鼠,暴露出氣管和雙肺。在氣管下部做橫行切口，夾閉右主支氣管，通過(guò)硅膠管用注射器從氣管緩緩注入無(wú)菌生理鹽水3 mL灌洗左肺，每次注入后立即回吸得到灌洗液，重復(fù)3次。灌洗液紗布(2層)過(guò)濾，回收率為80%～90%?；厥者^(guò)濾后的支氣管肺泡灌洗液(BALF)置于塑料離心管中，周圍用冰水(-4～0 ℃)包圍。

2.2.3 肺組織 取大鼠4葉右肺，用預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水沖洗3次，洗去凝血塊,用濾紙吸干后稱重，按W(重量)/V(體積)=1/5比例加入預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水，置于玻璃勻漿器中研磨15 min，制成10%肺組織勻漿。所有標(biāo)本立即于4 ℃下2 000 r/min離心15 min，取上清液-80 ℃保存待檢。

2.3 樣品前處理

2.3.1 肺組織樣品前處理 稱取一定量的肺組織勻漿置于50 mL離心管中,加入10 mL磷酸二氫鈉緩沖溶液，均質(zhì)，用10 mL磷酸二氫鈉溶液洗滌均質(zhì)器刀頭后并入離心管中。于振蕩器上震蕩10 min，超聲提取10 min。然后在4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上層液轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入10 mL正己烷，如上震蕩離心后棄去上層正己烷層和脂肪，下層提取液過(guò)6 cc HLB固相提取小柱(預(yù)先用5 mL甲醇，5 mL超純水活化)，5 mL水淋洗后抽干，最后用5 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于樣品管中，氮?dú)獯蹈珊笥靡译?水(v∶v=1∶9)定容至1 mL,稀釋100倍后過(guò)0.2 μm濾膜，供上機(jī)檢測(cè)。

2.3.2 血清樣品前處理 取50 μL血清樣品于1.5 mL離心管中,加入950 μL乙腈渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min。上清液全部轉(zhuǎn)移至收集管中，氮?dú)獯蹈珊笥? mL乙腈-水(1∶9)溶解，過(guò)3 cc HLB固相提取小柱(預(yù)先用3 mL甲醇，3 mL超純水活化)，3 mL水淋洗后抽干，最后用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于樣品管中,氮?dú)獯蹈珊笥靡译?水(v∶v=1∶9)定容至1 mL，稀釋20倍后過(guò)0.2 μm濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。

2.3.3 灌洗液樣品前處理 取100 μL灌洗液樣品于1.5 mL離心管中，加入900 μL乙腈渦旋混勻，8 000 r/min離心5 min。上清液全部轉(zhuǎn)移至收集管中，氮?dú)獯蹈珊笥? mL乙腈-水(v∶v=1∶9)溶解,過(guò)3 cc HLB固相提取小柱(預(yù)先用3 mL甲醇，3 mL超純水活化)，3 mL水淋洗后抽干，最后用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于樣品管中，氮?dú)獯蹈珊笥靡译?水(v∶v=1∶9)定容至1 mL，稀釋10倍后過(guò)0.2 μm濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。

2.4 標(biāo)本測(cè)定 采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物樣品中青霉素濃度。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)，配在線過(guò)濾器(Agilent公司)；流動(dòng)相A為0.1%乙酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.5 min，10%～70% B；1.5～3.0 min，70% B；3.0～3.1 min，70%～10% B；3.1～4.0 min，10% B；柱溫：35 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電離源：ESI-；毛細(xì)管電壓：3 000 V；霧化氣壓力:20 psi；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流量：11 L/min；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：15 L/min；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。青霉素G質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 青霉素G質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果

3.1 15 min標(biāo)本中青霉素濃度 見(jiàn)表2。

表2 15 min標(biāo)本中青霉素濃度 μg/L

注:※數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，故用中位數(shù)表示；與對(duì)照組比較，△P=0.008<0.05；與氨溴索組比較，△P=0.043<0.05；與二陳湯組比較，△P=0.026<0.05；與對(duì)照組比較，△△P=0.000<0.05；與氨溴索組比較，△△P=0.000<0.05；與二陳湯組比較，△△P=0.009<0.05

3.2 30 min標(biāo)本中青霉素濃度 見(jiàn)表3。

4 討論

結(jié)合當(dāng)前的研究文獻(xiàn)及既往的研究經(jīng)驗(yàn)，我們選擇了大鼠肺組織、血清及灌洗液作為觀察目標(biāo)。通過(guò)提高抗生素在肺組織內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高其肺內(nèi)感染區(qū)域的濃度，增加抗生素的治療效能[6-7]。

東直門(mén)醫(yī)院呼吸科在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)并提出氣虛血瘀痰阻是COPD穩(wěn)定期的核心病機(jī)[8-10]，而對(duì)于AECOPD,“痰”與“熱”是其中關(guān)鍵病機(jī)[11-13]，清熱化痰法是其基本治療原則[14]。本課題正是基于此，并借鑒國(guó)內(nèi)外研究思路，西藥以氨溴索[15]為對(duì)照，中藥以化痰方二陳湯為對(duì)照， 觀察以清熱化痰法指導(dǎo)的蔞芩止嗽煎[16]對(duì)抗生素在肺組織中的藥物濃度的影響，即對(duì)抗生素的增效作用的影響。蔞芩止嗽煎由《統(tǒng)旨方》中清金化痰湯加減組成。方中瓜蔞、黃芩、清半夏、浙貝母清熱化痰；漏蘆、連翹清熱解毒；杏仁、前胡宣降肺氣。

表3 30 min標(biāo)本中青霉素濃度 μg/L

注:※數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，故用中位數(shù)表示；與對(duì)照組比較，△P=0.055>0.05；與氨溴索組比較，△P=0.181>0.05；與二陳湯組比較，△P=0.753>0.05；與對(duì)照組比較，△△P=0.235>0.05；與氨溴索組比較，△△P=0.963>0.05；與二陳湯組比較，△△P=0.283>0.05

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在肺組織標(biāo)本中，AECOPD痰熱證大鼠模型在肌注青霉素15 min后組織藥物濃度以蔞芩止嗽煎組最高，提示清熱化痰法能提高AECOPD痰熱證大鼠肺組織中的青霉素濃度，并且療效優(yōu)于二陳湯，以及可以提高抗生素在肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的氨溴索。而30 min時(shí)肺組織中藥物濃度各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但蔞芩止嗽煎組與二陳湯組肺組織藥物濃度均高于氨溴索組和對(duì)照組，提示中藥化痰法對(duì)提高青霉素在肺組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)有一定的療效。綜合分析，基于清熱化痰法的蔞芩止嗽煎可以提高肺組織中青霉素藥物濃度，且以15 min時(shí)最明顯，而單純應(yīng)用化痰法治療AECOPD痰熱證起效相對(duì)較慢，提示對(duì)AECOPD痰熱證，在化痰基礎(chǔ)上及早應(yīng)用清熱藥物可以提高組織藥物濃度，從而提高治療效果。在血清標(biāo)本中，也有類似結(jié)果，進(jìn)一步提示，清熱化痰藥物對(duì)AECOPD血清及肺組織藥物濃度的影響具有一致性，及早應(yīng)用針對(duì)AECOPD痰熱證核心病機(jī)的清熱化痰藥物有助于提高藥物濃度，提高治療效果，縮短治療時(shí)間。而在灌洗液藥物濃度測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，不管是15 min組還是30 min組，提示蔞芩止嗽煎可以提高抗生素在肺灌洗液中的濃度，并加速抗生素在灌洗液中的分布，延長(zhǎng)起效作用時(shí)間。

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