宋小俊,雷 立,李惠民,李玉琴,高吉仁,何西珍,周曙東

(商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 商洛 726000)

連翹入藥在我國(guó)已有兩千多年的歷史，是我國(guó)臨床常用傳統(tǒng)中藥之一，主產(chǎn)于我國(guó)陜西、山西、河南、山東等地。明清以后至今皆以木犀科連翹的果實(shí)為連翹正品的唯一來(lái)源[1]。秋季果實(shí)初熟尚帶綠色時(shí)采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干，稱之為“青翹”；果實(shí)熟透時(shí)采收，曬干，除去雜質(zhì)，稱之為“老翹”[2]。中藥材連翹主要含有連翹苷、連翹酯苷、異落葉松脂素、異橄欖脂素、蘆丁、槲皮素等苯乙醇苷類、木脂素類、三萜類、黃酮類、酚酸類物質(zhì)[3-5]。連翹苦，微寒，歸肺、心、膽經(jīng)，具有清熱解毒，消癰散結(jié)，疏散風(fēng)熱的功效[6]。連翹具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗腫瘤等作用[7-9]。主治溫?zé)?、丹毒、斑疹、癰瘍腫毒、瘰疬、小便淋閉等癥；現(xiàn)代臨床上多用于治療呼吸道感染、急性腎炎、肝炎、腦膜炎等疾病[10]。連翹還是預(yù)防和治療禽流感、SARS、甲型H1N1流感等流行性疾病的主要藥物[2]。連翹是商洛市確定的“五大商藥”之一，在商洛的蘊(yùn)藏量大，分布區(qū)域廣。本研究藥材樣品采自商洛連翹各主要產(chǎn)區(qū)。以連翹苷和連翹酯苷A含量為指標(biāo)，按照中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn),采用高效液相色譜法對(duì)不同區(qū)縣青翹和老翹中連翹苷、連翹酯苷A含量進(jìn)行比較研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

連翹果實(shí)采自商洛五縣區(qū)7個(gè)樣點(diǎn)。經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)梁宗鎖教授鑒定均為正品。2011年7月采集樣品，將所采連翹果實(shí)蒸熟、曬干，得“青翹”備用。2011年10月采集樣品，將所采連翹果實(shí)曬干，除去雜質(zhì),得“老翹”備用。連翹苷及連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，甲醇、乙腈等化學(xué)試劑均為色譜純，冰醋酸為分析純，試驗(yàn)用水為純凈水。LC-10AT島津高效液相色譜儀，SPD-10A紫外-可見檢測(cè)器，浙江大學(xué)N2000色譜工作站;WK-1000A型高速中藥粉碎機(jī)(青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司);AUW220型萬(wàn)分之一電子天平(SARTOO-RIUS公司)；KQ5200B型超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司)；R501B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(無(wú)錫市星海王生化設(shè)備有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司);電熱恒溫DGG-9203AD型鼓風(fēng)真空干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參照中國(guó)藥典方法[6]作適當(dāng)調(diào)整。色譜柱：C18(10 μm，250 mm×4.6 mm)；連翹苷流動(dòng)相：乙腈-水(30∶70)；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。連翹酯苷A流動(dòng)相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液(15∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng):333 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取連翹苷及連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定。于10 mL容量瓶中甲醇溶解，精確定容至刻度線，得對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取采自不同產(chǎn)地的青翹和老翹干燥粉末(過(guò)五號(hào)篩)各1.000 g，至50 mL錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，過(guò)夜，超聲波提取30 min，搖勻，濾過(guò)，靜置,取上清液移入10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，得連翹苷供試品溶液。

精密稱取采自不同產(chǎn)地的青翹和老翹干燥粉末(過(guò)五號(hào)篩)各1.000 g,至50 mL錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，超聲波提取30 min,搖勻，濾過(guò)，取上清液移入10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，得連翹酯苷A供試品溶液。

2.4 相關(guān)性分析 分別精密吸取連翹苷、連翹酯苷A對(duì)照品溶液0.1、0.25、0.50、0.75、1.0 mL置l mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。依次吸取上述溶液10 μL，注入HPLC色譜儀，記錄峰面積。以連翹苷、連翹酯苷A的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸處理得進(jìn)樣量濃度與峰面積的相關(guān)系數(shù)分別為，r(連翹苷)=0.998 9，r(連翹酯苷A)=0.999 1。表明連翹苷、連翹酯苷A含量和其峰面積之間有很好的相關(guān)性。

2.5 精密度試驗(yàn) 取連翹苷、連翹酯苷A對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果連翹苷、連翹酯苷A的峰面積RSD分別小于1.624%，1.461%。表明試驗(yàn)用儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取新制備的供試品溶液10 μL，分別靜置0、2、4、8、16、24 h,注入色譜柱，記錄峰面積，結(jié)果青翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別小于1.0%，1.18%；老翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別小于1.14%，1.07%。說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 供試品含量測(cè)定 精密吸取藥材供試品溶液10 μL進(jìn)樣，采用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表1、表2。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別取青翹和老翹藥材樣品制備供試品溶液6份,依次進(jìn)樣，記錄峰面積，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間均小于0.20%， 結(jié)果青翹樣品中連翹翹苷、連翹酯苷A含量的RSD分別小于1.20%，1.26%；老翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A含量的RSD分別小于1.14%，1.12%。證明此方法重現(xiàn)性良好。

表1 不同產(chǎn)地青翹和老翹中連翹苷含量(n=3) %

表2 不同產(chǎn)地青翹和老翹中連翹酯苷A含量(n=3) %

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品1.000 g,分別加入連翹苷、連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品適量，按照2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別得到連翹苷、連翹酯苷A加樣回收樣品，測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果:青翹樣品中連翹苷的平均回收率為99.54%，RSD為1.38%；連翹酯苷A的平均回收率為99.7%，RSD為1.72%。老翹樣品中連翹苷的平均回收率為99.51%,RSD為1.34%；連翹酯苷A的平均回收率為99.64%，RSD為1.27%。

3 分析與討論

連翹的藥用成分較多，關(guān)于研究方法的報(bào)道也逐年增加。崔洋等[11]對(duì)連翹進(jìn)行了高效液相色譜指紋圖譜研究。吳艷芳等[12]對(duì)伏牛山區(qū)青翹與老翹中連翹苷含量進(jìn)行了測(cè)定。朱小強(qiáng)等[13-14]對(duì)商洛連翹GAP栽培技術(shù)和增產(chǎn)效果進(jìn)行了研究,但以商洛不同產(chǎn)地連翹藥材為研究對(duì)象,結(jié)合藥物分析對(duì)主成分連翹苷、連翹酯苷A進(jìn)行分析研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)采用HPLC-RPBPCF法，對(duì)來(lái)自商洛五縣區(qū)不同產(chǎn)地的青翹和老翹藥材進(jìn)行色譜分析。測(cè)定連翹苷、連翹酯苷A含量,采用外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算，并進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率試驗(yàn)。結(jié)果證明，該方法可靠，重復(fù)性好，供試品藥材的主要成分連翹苷、連翹酯苷A含量高而且穩(wěn)定。

各產(chǎn)地青翹中連翹苷含量均高于老翹，與吳艷芳研究結(jié)果一致[12]，不同產(chǎn)地青翹、老翹中連翹苷含量差異明顯。

各產(chǎn)地青翹中連翹酯苷A含量均高于老翹，不同產(chǎn)地青翹、老翹中連翹酯苷A含量差異十分明顯。

除洛南石門老翹樣品中連翹苷含量為0.106%,其余樣品中連翹苷含量均大于中國(guó)藥典規(guī)定的0.15%[6]，最高含量達(dá)中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)的5.5倍。所有樣品連翹酯苷A含量均大于中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)(0.25%)[6],且最高含量達(dá)中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)的50倍左右，最低含量也超出中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)約1.5倍。表明做為商洛“五大商藥”之一的連翹，其藥用主要成分含量極高，具有良好的開發(fā)價(jià)值。

由于不同產(chǎn)地連翹苷、連翹酯苷A含量差異較大,故在實(shí)施商洛連翹藥材的人工種植時(shí)，必須重視種質(zhì)的選擇，建立GAP基地，掌握科學(xué)的采摘時(shí)間,以保證商洛道地藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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