NO和H2O2在沙打旺抗黃矮根腐病反應(yīng)中的互作

黃貝梅，南志標(biāo)

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

NO和H2O2在沙打旺抗黃矮根腐病反應(yīng)中的互作

黃貝梅，南志標(biāo)

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

本研究以沙打旺(Astrgalusadsurgens)感病品種寧夏彭陽為試驗材料，接種沙打旺埃里磚格孢(Embellisiaastragali)后分別施加外源NO及H2O2清除劑抗壞血酸，測定H2O2含量和H2O2代謝酶SOD、POD和CAT活性，以此來探討H2O2在由NO誘導(dǎo)的防御反應(yīng)中發(fā)揮的作用。與對照相比，外源NO顯著降低(P<0.05)沙打旺發(fā)病率和病情指數(shù)，在開始階段，外源NO可以誘導(dǎo)內(nèi)源H2O2產(chǎn)生，在后期，當(dāng)H2O2濃度相對較高，外源NO會延遲H2O2積累，但用NO和H2O2清除劑同時處理H2O2含量與對照并無顯著差異(P>0.05)。NO處理能夠誘導(dǎo)SOD、POD和CAT活性增加，H2O2清除劑抑制了NO對3種酶的調(diào)控作用。施加外源NO能增強(qiáng)沙打旺抗病性，NO通過調(diào)控內(nèi)源H2O2含量發(fā)揮作用。

NO；H2O2；沙打旺；埃里磚格孢；抗氧化酶

NO和H2O2是植物體內(nèi)兩種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，廣泛參與植物生長發(fā)育以及抗病等各種抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[1]。外源NO能激活大豆(Glycinemax)和煙草(Nicotianatabacum)一系列抗病相關(guān)基因表達(dá)[2-3]，提高防御酶活性[2]。NO在植物抗病反應(yīng)中可作為信號物質(zhì)與活性氧協(xié)同作用[4]，H2O2作為活性氧，在植物抵抗病原體感染過程中有重要作用[5]。

沙打旺(Astrgalusadsurgens)是多年生豆科牧草，但其草地利用年限較短，經(jīng)濟(jì)利用期僅2～3年，5年后開始衰退[6]。病害是造成沙打旺衰退的主要原因之一，沙打旺黃矮根腐病是2007年[7]報道的一種沙打旺新病害，其病原真菌為沙打旺埃里磚格孢(Embellisiaastragalisp.nov.Li&Nan)，該病菌可以引起植物矮化、莖稈變黃、根部腐爛，極大地降低沙打旺的產(chǎn)量、縮短其利用年限。不同沙打旺品種(品系)對該病的抗病性水平存在差異，其中陜西榆林和中沙一號為抗病品種，內(nèi)蒙早熟和寧夏彭陽為感病品種[8]。

目前，關(guān)于NO和H2O2在植物病害防御中的互作，相關(guān)學(xué)者已經(jīng)開展了一系列研究[9-10]，但對其調(diào)控機(jī)理仍存在爭議[11]。NO和H2O2的動態(tài)平衡是建立病害防御的必要條件[11]。Neill等[1]認(rèn)為，NO和H2O2可能是脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心環(huán)節(jié)，介導(dǎo)了多種信號途徑。過氧化氫代謝酶已被證明受NO供體的影響[12-13]。然而，關(guān)于NO和H2O2在牧草抗病反應(yīng)中互作的研究很少。為深入了解沙打旺抗黃矮根腐病的作用機(jī)制，采取合理的防治方法，對該病害進(jìn)行有效控制，本研究以寧夏彭陽沙打旺為試驗材料，通過測定H2O2含量和H2O2代謝酶活性分析H2O2在NO引導(dǎo)的防御反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的沙打旺品種為寧夏彭陽，由中國科學(xué)院水利部水土保持研究所提供，種子保存在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子庫(4 ℃)。

供試沙打旺埃里磚格孢分離自采于甘肅省環(huán)縣草地畜牧業(yè)綜合試驗場(37°7′ N，106°49′ E，海拔1 650 m)的沙打旺發(fā)病莖稈。盆栽試驗在蘭州大學(xué)榆中智能溫室中進(jìn)行，供試土壤為營養(yǎng)土與黃綿土1∶1混合，經(jīng)169 ℃滅菌6 h[14]后裝入經(jīng)0.2%高錳酸鉀消毒的塑料盆內(nèi)，每盆2 kg，塑料盆規(guī)格為15 cm × 15 cm(直徑×高)。

其他試驗條件保持一致，溫度白天25 ℃，夜間20 ℃，12 h光照12 h黑暗交替、光照8 000～10 000 lx，相對濕度65%。每隔一周重新排列各試驗盆的位置，以消除不同位置光照條件、通風(fēng)條件可能存在的差異。

1.2 試驗處理

2012年4月20日播種，隨機(jī)區(qū)組擺放，出苗后選擇長勢一致的沙打旺幼苗，每盆定苗4株。90 d后，用噴霧法接種埃里磚格孢懸浮液(1×105個·mL-1)，接種后第2天按以下設(shè)計進(jìn)行處理，1)0.5 mmol·L-1NO供體硝普鈉(Sodium Nitroprusside，SNP)；2)0.5 mmol·L-1SNP和0.2 mmol·L-1H2O2清除劑抗壞血酸(Ascorbic Acid，AsA)；3)空白(無菌水)為對照，每處理4個重復(fù)，對各處理的重復(fù)進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組擺放。試驗所用試劑為經(jīng)測定對孢子萌發(fā)沒有影響的濃度。分別于處理0、0.5、1、2、3、4、5 d取植株中間部位葉片帶回實驗室測定H2O2含量以及酶活性，1個月后統(tǒng)計發(fā)病率，計算病情指數(shù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)病率和病情指數(shù) 沙打旺黃矮根腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)統(tǒng)計方法同文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 H2O2含量測定 取沙打旺葉片組織0.3 g，加入丙酮研磨成漿；3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，依次加入硫酸鈦和濃氨水；5 000 r·min-1離心10 min后棄上清，洗滌5次，用硫酸溶解沉淀在450 nm波長下測定吸光度值，計算葉片組織中H2O2含量[15]。

1.3.3 酶活性測定 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性的測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法[16]，過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性的測定采用李合生[16]的愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性的測定采用紫外吸收法[17]。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003進(jìn)行作圖，用SPSS 17.0對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病率和病情指數(shù)

SNP處理顯著(P<0.05)降低了黃矮根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)，與對照相比分別降低了30.7%和28.4%(圖1)。SNP和AsA共同處理減弱了SNP的處理效果，發(fā)病率和病情指數(shù)分別較SNP處理高34.9%和32.6%，與對照差異不顯著(P>0.05)。

圖1 硝普鈉(SNP)與抗壞血酸(AsA)處理對發(fā)病率和病情指數(shù)的影響

注：不同小寫字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。

Note: Different lower case letters mean significant differences among treatments at 0.05 level.

2.2 過氧化氫含量

比較SNP處理與對照H2O2含量，對照中檢測到2個H2O2峰值，分別在1 d和3 d(圖2)。SNP處理第1個峰值與對照相比提前，出現(xiàn)在處理后0.5 d，第2個峰值較第1個高，施加SNP的處理峰值延遲出現(xiàn)，說明H2O2含量受NO調(diào)控。SNP和AsA共處理條件下，處理后1、2 d H2O2含量較對照顯著減少(P<0.05)，之后變化趨勢與對照相似，但始終低于對照。說明H2O2清除劑減弱了NO對H2O2含量的調(diào)控。

圖2 硝普鈉(SNP)與抗壞血酸(AsA)處理對H2O2含量的影響

注：同一時間不同小寫字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。以下同。

Note: Different lower case letters mean significant differences among treatments at 0.05 level. The same below.

2.3 SOD、POD、CAT活性

SNP處理SOD活性迅速升高，隨后緩慢下降，處理后0.5 d時較對照高62.7%，而對照SOD峰值出現(xiàn)在處理后3 d，然后下降，SNP處理SOD活性呈持續(xù)上升趨勢。SNP和AsA共同處理影響了NO的作用，SOD活性始終低于SNP處理，在處理后3 d達(dá)到峰值后開始下降。說明NO誘導(dǎo)的SOD活性增加被H2O2清除劑抑制。

SNP處理的POD活性在處理后1 d時較對照低，隨后明顯增加(圖4)。對照峰值出現(xiàn)在處理后2 d，SNP處理峰值出現(xiàn)在處理后3 d，比對照峰值高30.9%。SNP和AsA共處理POD峰值出現(xiàn)在處理后2 d，處理2 d后POD活性顯著低于SNP處理(P<0.05)，說明H2O2清除劑抑制了NO對POD的作用。

圖3 硝普鈉(SNP)與抗壞血酸(AsA)處理對SOD活性的影響

圖4 硝普鈉(SNP)與抗壞血酸(AsA)處理對POD活性的影響

整個檢測期間，SNP處理分別在處理后0.5 d和3 d時檢測到CAT活性峰值，對照峰值出現(xiàn)在處理后2 d，SNP處理3 d的峰值較對照峰值高17.4%。SNP和AsA共處理CAT變化趨勢與對照相似，說明H2O2清除劑抑制了NO對CAT的作用(圖5)。

圖5 硝普鈉(SNP)與抗壞血酸(AsA)處理對CAT活性的影響

3 討論與結(jié)論

盡管NO是植物響應(yīng)生物脅迫的信號分子已被普遍接受，其作為信號分子的功能模式需要深入的研究，特別是與其他信號分子的交互作用[18]。H2O2被認(rèn)為是多種防御反應(yīng)中的信號分子，植物中NO與H2O2協(xié)同防御病害，它們之間的互作可能補(bǔ)充防御機(jī)制中的功能[1]。本研究以沙打旺為材料，研究了NO和H2O2在沙打旺抗病反應(yīng)中的互作。

Fan等[9]發(fā)現(xiàn)，NO處理降低了番茄(Lycopersiconesculentum)的發(fā)病率，而NO和H2O2清除劑共同處理的番茄發(fā)病率與對照無顯著差異，即H2O2清除劑削弱了NO的作用，可見，H2O2參與NO調(diào)控的番茄抗病反應(yīng)。本研究中，SNP處理降低了沙打旺發(fā)病率和病情指數(shù)，SNP和AsA共處理減弱了SNP處理效果，表明NO誘導(dǎo)了植物對病原體入侵和生長的防御反應(yīng)，缺少H2O2，NO的防御能力降低，故H2O2參與了NO誘導(dǎo)的沙打旺防御反應(yīng)過程。

NO可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源H2O2含量參與各種脅迫下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并在下游誘導(dǎo)相關(guān)防御基因的表達(dá)[19]。在植物內(nèi)NO對H2O2含量既有促進(jìn)也有抑制作用。呂東等[20]研究表明，H2O2能誘導(dǎo)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生，而NO不能誘導(dǎo)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生，H2O2可能作為NO的上游分子來介導(dǎo)由ABA誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生過程。屠潔等[21]認(rèn)為NO可通過對抗氧化酶的不同抑制作用來調(diào)節(jié)小麥(Triticumaestivum)葉片內(nèi)源H2O2含量。Clark等[22]提出NO可能是通過調(diào)節(jié)內(nèi)源H2O2代謝來參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。本研究中，當(dāng)H2O2含量較低時，NO處理提前了H2O2峰值，當(dāng)H2O2含量高到可能對植物細(xì)胞造成傷害時，NO處理延遲了H2O2峰值。以上結(jié)果表明，NO能夠調(diào)控內(nèi)源H2O2含量，且其調(diào)控能力與H2O2濃度相關(guān)。在植物中，H2O2可能扮演兩個相反角色：H2O2在各種脅迫下產(chǎn)生來增加保護(hù)酶基因的表達(dá)；然而，高濃度的H2O2會對植物造成氧化破壞[12]。由本研究結(jié)果可以看出，H2O2低濃度時，NO誘導(dǎo)其產(chǎn)生增強(qiáng)防御反應(yīng)，高濃度時抑制H2O2積累以避免損傷細(xì)胞。處理早期AsA有效清除了H2O2，從而維持正常的H2O2含量。由于AsA作用，NO對H2O2調(diào)控通道被打破，這可能是NO誘導(dǎo)抗病被AsA削弱的原因。

SOD是活性氧清除反應(yīng)過程中第1個發(fā)揮作用的抗氧化酶，它催化·O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，將其快速歧化為H2O2和分子氧，從而清除·O2-。在隨后的反應(yīng)中，H2O2在CAT、POD和抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友鮗23]。關(guān)于NO在不同條件下不同植物中影響SOD、POD和CAT活性已有報道。Uchida等[12]研究表明，NO對NaCl脅迫下水稻(Oryzasativa)幼苗的生長具有促進(jìn)作用，并提高了SOD、POD和CAT的活性。廖偉彪等[13]研究表明，適宜濃度的NO和H2O2處理可提高地被菊(Dendranthemamorifolium)插穗的SOD活性，降低POD的活性。在本研究中，NO處理早期，SOD活性顯著增強(qiáng)，促使H2O2產(chǎn)生。同時，作為清除H2O2的主要酶，POD活性降低了；后期，清除H2O2的酶POD和CAT與對照相比顯著增加，從而導(dǎo)致NO處理后期H2O2含量降低。H2O2降低破壞了原來的平衡，從而影響NO的作用，故H2O2清除劑處理抑制了NO對這些酶的作用，表明SOD、POD和CAT參與NO調(diào)控H2O2含量。施加外源性NO可以提高沙打旺抗病性，而NO誘導(dǎo)的防御反應(yīng)需要H2O2存在。外源NO最初誘導(dǎo)內(nèi)源性H2O2產(chǎn)生，但H2O2在高濃度時延遲H2O2積累，表明植物病害防御反應(yīng)中，NO和H2O2相互作用，可能通過調(diào)控H2O2含量發(fā)揮其效果。

本研究初步揭示了NO和H2O2在病害防御過程中可能通過互作反應(yīng)提高各自的信號水平。然而，關(guān)于該過程中NO和H2O2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步研究。

[1] Neill S J，Desikan R，Clarke A，Hurst R D，Hancock J T.Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants[J].Journal of Experimental Botany，2002，53:1237-1247.

[2] Durner J，Wendehenne D，Klessig D F.Defense gene induction in tobacco by nitric oxide，cyclic GMP，and cyclic ADP-ribose[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1998，95:10328-10333.

[3] Delledonne M，Xia Y，Dixon R A，Lamb C.Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance [J].Nature，1998，394:585-588.

[4] 劉新，張蜀秋，婁成后.氣孔運(yùn)動調(diào)控中過氧化氫和一氧化氮信號途徑的交叉作用[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2003，13:355-358.

[5] Romero-Puertas M C，Perazzolli M，Zago E D，Delledonne M.Nitric oxide signalling functions in plant-pathogen interactions[J].Cellular Microbiology，2004，6:795-803.

[6] 孫啟忠.赤峰地區(qū)不同生長年限沙打旺生產(chǎn)力的研究[J].中國草地，1999(5):29-34.

[7] 李彥忠.沙打旺(Astragalusadsurgens)黃矮根腐病(Embellisiaastragali)的研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2007.

[8] 俞斌華.沙打旺(Astragalusadsurgens)品種對黃矮根腐病(Embellisiaastragali)的抗性評價[D].蘭州:蘭州大學(xué)，2011.

[9] Fan B，Shen L，Liu K，Zhao D，Yu M M，Sheng J P.Interaction between nitric oxide and hydrogen peroxide in postharvest tomato resistance response toRhizopusnigricans[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2008，88:1238-1244.

[10] 林志強(qiáng)，郭秀萍，車永梅，盧江，劉新.NO和H2O2提高葡萄抗霜霉病的生理作用機(jī)制[J].植物病理學(xué)報，2011，41(6):576-586.

[12] Uchida A，Jagendorf A T，Hibino T，Takabe T，Takabe T.Effects of hydrogen peroxide and nitric oxide on both salt and heat stress tolerance in rice[J].Plant Science，2002，163:515-523.

[13] 廖偉彪，張美玲，吳永華，肖洪浪.一氧化氮和過氧化氫對地被菊扦插生根的影響[J].園藝學(xué)報，2009，36:1643-1650.

[14] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1979:197-230.

[15] Karkonen A，Warinowski T，Teeri T H，Siloma L K，F(xiàn)ry S C.On the mechanism of apoplastic H2O2production during lignin formation and elicitation in cultured spruce cells-peroxidases after elicitation[J].Planta,2009,230(3):553-567.

[16] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000:164-169.

[17] Larrigaudiere C，Vilaplana R，Soria Y，Kan J.Oxidative behavior of Blanquilla pears treated with 1-methylcyclopropene during cold storage[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2004，84:1871-1877.

[18] Arasimowicz M，F(xiàn)loryszak-Wieczorek J.Nitric oxide as a bioactive signalling molecule in plant stress responses[J].Plant Science，2007，172:876-887.

[19] Kolbert Z，Bartha B，Erdei L.Exogenous auxin-induced NO synthesis is nitrate reductase-associated inArabidopsisthalianaroot primordia[J].Journal of Plant Physiology，2008，165:967-975.

[20] 呂東，張驍，江靜，安國勇，張玲瑞，宋純鵬.NO可能作為H2O2的下游信號介導(dǎo)ABA誘導(dǎo)的蠶豆氣孔關(guān)閉[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2005，31(1):62-70.

[21] 屠潔，沈文飚，葉茂炳，徐朗萊.外源NO供體對小麥離體葉片過氧化氫代謝的影響[J].植物學(xué)通報，2002，19(3):336-341.

[22] Clark D，Durner J，Navarre D A，Klessig D F.Nitric oxide inhibition of tobacco catalase and ascorbate peroxidase[J].Molecular Plant-Microbe Interactions，2000，13:1380-1384.

[23] 高必達(dá)，陳捷.生理植物病理學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2006:115-138.

(責(zé)任編輯 武艷培)

The impacts of interaction between NO and H2O2onAstrgalusadsurgensresponse toEmbellisiaastragali

HUANG Bei-mei， NAN Zhi-biao

(State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

A disease susceptible cultivar ofAstrgalusadsurgenswas applied with exogenous NO and AsA after inoculatingEmbellisiaastragali. Disease incidence (DI), disease severity index (DSI), H2O2concentration, superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) activity were analyzed to investigate the interaction between NO and H2O2during disease development. Compared with control plants, DI and DSI of NO treatment plants significantly decreased (P<0.05). AsA treatment weakened the effects of NO. NO could induce more H2O2during the earlier period. However, NO delayed H2O2accumulation during the later period that concentration of H2O2was relatively higher. The increasement of SOD, POD and CAT activity induced by NO was inhibited by AsA. The results showed that exogenous NO implication could improve the disease resistance ofA.adsurgens. NO may interact with H2O2and exert its effect by modulating the endogenous H2O2level.

NO；H2O2;Astrgalusadsurgens;Embellisiaastragali; antioxidant enzyme

NAN Zhi-biao E-mail:zhibiao@lzu.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0320

2013-06-21 接受日期：2013-08-27

牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS35-08)

黃貝梅(1988-)，女，河南虞城人，碩士，研究方向為沙打旺病害防治。E-mail:huangbm07@lzu.edu.cn

南志標(biāo)(1951-)，男，河北曲陽人，教授，博士，研究方向為草業(yè)科學(xué)。E-mail:zhibiao@lzu.edu.cn

S435.4

A

1001-0629(2014)06-1028-05*1