野生及栽培苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性的同工酶分析

陳立強(qiáng)，師尚禮，馬春暉

(1．塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

野生及栽培苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性的同工酶分析

陳立強(qiáng)1，師尚禮2，馬春暉3

(1．塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

采用過(guò)氧化物酶、淀粉酶、過(guò)氧化氫酶電泳技術(shù)，對(duì)兩份野生紫花苜蓿(Medicagosativa)種質(zhì)資源和27份栽培苜蓿品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，3種同工酶共檢測(cè)到30條穩(wěn)定酶帶，其中6條為特異酶帶，出現(xiàn)在隴東野生紫花苜蓿、拜城野生紫花苜蓿、蘭杰蘭德和大西洋紫花苜蓿酶譜中。過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和淀粉酶的多態(tài)位點(diǎn)百分率分別為75.00%、55.56%和33.33%。29份苜蓿材料間的相似系數(shù)介于0.633～1.000，平均值為0.867，兩份野生紫花苜蓿種質(zhì)資源與栽培品種間的相似系數(shù)相對(duì)較小，栽培品種間的相似系數(shù)相對(duì)較大。聚類分析表明，在相似系數(shù)0.772處可將29份苜蓿材料聚為3類，第1和第2類分別由隴東野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿單獨(dú)組成。隴東野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿在主成分分析圖中的位置也相對(duì)孤立，表現(xiàn)出野生種質(zhì)資源與栽培品種間較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

苜蓿；野生種質(zhì)資源；栽培品種；同工酶；遺傳多樣性

紫花苜蓿(Medicagosativa)起源于小亞細(xì)亞、外高加索、伊朗和土庫(kù)曼高地，產(chǎn)量高、品質(zhì)好、營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好，被譽(yù)為“牧草之王”，是世界上栽培面積最廣，最主要的豆科牧草之一[1-2]。20世紀(jì)末，我國(guó)苜蓿種植面積達(dá)200萬(wàn)hm2，居世界第5位。近年來(lái)，特別是受2008年三聚氰胺事件的影響，苜蓿在奶業(yè)安全發(fā)展中的重要性突出體現(xiàn)，種植面積逐年擴(kuò)大[3-4]。遺傳多樣性是確保物種延續(xù)和不斷進(jìn)化的關(guān)鍵，開(kāi)展苜蓿遺傳多樣性研究，對(duì)擴(kuò)大品種的遺傳基礎(chǔ)和選育新品種均有重要作用。

目前，國(guó)內(nèi)外在苜蓿遺傳多樣性方面做了大量工作，已從形態(tài)學(xué)水平[5]、細(xì)胞學(xué)水平[6]、生理生化水平[7]、分子水平[8]對(duì)苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了研究，所涉及的苜蓿屬植物包括紫花苜蓿[9]、雜花苜蓿(M.varia)[10]、黃花苜蓿(M.falcata)[11]、天藍(lán)苜蓿(M.lupulina)[12]、扁蓿豆(M.ruthenica)[13]、南苜蓿(M.polymorpha)[14]、蒺藜苜蓿(M.truncatula)、蝸牛苜蓿(M.scutellata)、刺球苜蓿(M.sphaerocarpos)及海濱苜蓿(M.littoralis)[15]等，研究對(duì)象也包含了品種[16]、品系[17]、居群[18]、野生資源[19]等。各研究采用不同的方法對(duì)苜蓿材料間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，取得了豐碩的成果，為苜蓿種質(zhì)資源研究、保護(hù)和利用提供了科學(xué)依據(jù)，但苜蓿種質(zhì)資源種類多、數(shù)量大、分布廣，目前各研究所涉及的材料都非常有限。近年來(lái)，隨著苜蓿種質(zhì)資源數(shù)量的急劇增加，特別是野生種質(zhì)資源、育成品種和引進(jìn)品種的不斷增加，苜蓿遺傳多樣性研究需要不斷補(bǔ)充，為苜蓿育種提供依據(jù)。

同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其蛋白多肽鏈結(jié)構(gòu)中的氨基酸排列順序是由DNA上結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息所決定的，通過(guò)酶譜分析，就能識(shí)別控制這些譜帶表達(dá)的基因，從而從本質(zhì)上揭示材料間的遺傳差異[20]。自1972年Miller首次用同工酶技術(shù)鑒定了苜蓿雜交種之后，目前該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于苜蓿遺傳多樣性檢測(cè)[21-22]。本研究采用過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、淀粉酶對(duì)兩份野生紫花苜蓿種質(zhì)資源和27份栽培苜蓿品種的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，以期為進(jìn)一步開(kāi)展苜蓿品種遺傳改良、雜交親本選配以及野生種質(zhì)資源的利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括野生紫花苜蓿材料兩份，栽培品種27份(表1)。隴東野生紫花苜蓿分布于甘肅清水半陰濕山腳地帶，與栽培紫花苜蓿相比，其根系具有根莖，水平或斜生，無(wú)主根，莖細(xì)且硬，抗寒抗旱，耐牧，有許多栽培苜蓿所不具有的植物學(xué)和生物學(xué)特征[23]。拜城野生苜蓿分布于新疆拜城，具有發(fā)達(dá)的根系，匍匐生長(zhǎng)，與栽培品種相比，具有明顯的株高優(yōu)勢(shì)。

1.2 方法

1.2.1 酶液的提取 淀粉酶(AMY，EC 3.1.1.1)和過(guò)氧化氫酶(CAT，EC 1.11.1.6)從種子中提取，用浸泡24 h的種子提取酶液；過(guò)氧化物酶(POD，EC 1.11.1.7)從發(fā)芽后第8天的幼苗中提取。隨機(jī)選取40株幼苗或40粒吸漲種子，置于冰浴中研磨，并按照1 g材料加4 mL提取緩沖液的比例，陸續(xù)加入預(yù)冷的0.1 mol·L-1Tric-HCl(pH為8.0)緩沖液[24]。充分研磨后取2 mL勻漿迅速轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，在4 ℃冷凍離心機(jī)中以8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入等體積40%的蔗糖溶液制成樣品液，混勻后分裝于1.5 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆肹25]。

1.2.2 電泳及染色 本試驗(yàn)采用聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳技術(shù)，膠板厚1.5 mm。濃縮膠和分離膠濃度、凝膠配比及電極緩沖液離子強(qiáng)度參照周延清等[20]的配方，并做適當(dāng)調(diào)整。進(jìn)樣量20 μL，以2%的溴酚藍(lán)作前沿指示劑，恒壓電泳，濃縮膠100 V，分離膠200 V，待指示移至玻璃板末端時(shí)停止電泳，進(jìn)行剝膠，并參照張維強(qiáng)和唐秀芝[26]的方法進(jìn)行染色，等酶譜清晰后，過(guò)氧化氫酶和淀粉酶需立即統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并照相，過(guò)氧化物酶凝膠需在蒸餾水中浸泡1～2 d，等酶帶變成棕紅色后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并照相。

表1 供試苜蓿材料及原產(chǎn)地

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)所統(tǒng)計(jì)酶譜帶的有無(wú)，把有帶計(jì)為1，無(wú)帶計(jì)為0，獲得“1，0”原始數(shù)據(jù)矩陣。計(jì)算各酶帶的遷移率(Rf)，Rf=酶帶中心的遷移距離/指示劑的遷移距離。計(jì)算各酶的多態(tài)位點(diǎn)百分率(Percentage of Polymorphic Bands，PPB)，PPB=(NPB/TNB)×100%，式中，NPB(Number of Polymorphic Bands)為多態(tài)性條帶數(shù)，TNB(Total Number of Bands)為總條帶數(shù)。采用NTSYSpc 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算供試材料間的相似系數(shù)(Genetic Similarity，GS)，GS=2Nij/(Ni+Nj)，式中，Nij為材料i和j共有的酶帶數(shù)，Ni為材料i的酶帶數(shù)，Nj為材料j的酶帶數(shù)。利用SHAN 程序，以非加權(quán)類平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)進(jìn)行聚類分析，并繪制相似系數(shù)樹狀聚類圖和主成分分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 同工酶酶帶分布特征

29份苜蓿材料的過(guò)氧化物酶共表現(xiàn)出12條酶帶(圖1)，Rf值介于0.265～0.850(表2)，其中Rf為0.350、0.430、0.600的酶帶是供試材料的共有帶，Rf為0.265、0.290、0.380、0.500、0.560、0.640、0.740、0.800和0.850的9條帶為多態(tài)性酶帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為75.00%。Rf為0.290的酶帶僅出現(xiàn)在蘭杰蘭德紫花苜蓿酶譜中，Rf為0.500的酶帶僅出現(xiàn)在隴東野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿酶譜中，Rf為0.380、0.740、0.800和0.850的酶帶在拜城野生紫花苜蓿酶譜中缺失。供試材料的過(guò)氧化氫酶共表現(xiàn)出了9條酶帶(圖2)，Rf值介于0.275～0.800(表2)，Rf為0.275、0.335、0.590和0.620的酶帶為共有酶帶，Rf為0.295、0.350、0.415、0.510和0.800的酶帶為多態(tài)性酶帶,多態(tài)位點(diǎn)百分率為55.56%。Rf為0.350、0.510的酶帶僅出現(xiàn)在隴東野生紫花苜蓿酶譜中，Rf為0.800的酶帶僅出現(xiàn)在大西洋紫花苜蓿酶譜中，Rf為0.415的酶帶僅在隴東野生紫花苜蓿酶譜中缺失。淀粉酶共表現(xiàn)出了9條酶帶(圖3)，Rf值介于0.300～0.840(表2)，Rf為0.300、0.340、0.380、0.430、0.470和0.840的酶帶為共有帶，Rf為0.530、0.740和0.790的酶帶為多態(tài)性酶帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為33.33%。Rf為0.530的酶帶僅出現(xiàn)在大西洋紫花苜蓿酶譜中。

圖1 29份苜蓿材料過(guò)氧化物酶(EC 1.11.1.7)電泳圖

注：圖中序號(hào)與表1同。圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、表3同。

Note:Numbers of the accessions refer to Table 1. The same in Fig.2, Fig.3, Fig.4, Fig.5, Fig.6, and Table 3.

圖2 29份苜蓿材料過(guò)氧化氫酶(EC 1.11.1.6)電泳圖

圖3 29份苜蓿材料淀粉酶(EC 3.1.1.1)電泳圖

同工酶Isozyme酶代號(hào)E.C.No.酶帶編號(hào)及遷移率Bandnumbersandtheirmoblities123456789101112POD1.11.1.70.2650.2900.3500.3800.4300.5000.5600.6000.6400.7400.8000.850CAT1.11.1.60.2750.2950.3350.3500.4150.5100.5900.6200.800AMY3.1.1.10.3000.3400.3800.4300.4700.5300.7400.7900.840

注：POD為過(guò)氧化物酶；CAT為過(guò)氧化氫酶；AMY為淀粉酶。

Note:POD is peroxidase; CAT is catalase; AMY is amylase.

綜上，3種同工酶在29份苜蓿材料中共檢測(cè)出了30條酶帶，包括13條共有酶帶(POD，3條；CAT，4條；AMY，6條)和17條多態(tài)性酶帶(POD，9條；CAT，5條；AMY，3條)。

2.2 供試材料間的相似系數(shù)

相似系數(shù)是用來(lái)比較群體或個(gè)體間相似程度的度量參數(shù)，平均相似系數(shù)越高，說(shuō)明相似程度越大，遺傳背景一致性越強(qiáng)[27]。用NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算出供試材料間的相似系數(shù)矩陣(表3)，共獲得29份苜蓿材料406對(duì)兩兩不同種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)，相似系數(shù)介于0.633～1.000，平均值為0.867，其中隴東野生紫花苜蓿與蘭杰蘭德間的相似系數(shù)最小(GS=0.633)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其次是拜城野生紫花苜蓿與維多利亞(GS=0.677)，然后是隴東野生紫花苜蓿與大西洋、隴東野生紫花苜蓿與IS-1044、隴東野生紫花苜蓿與敖德薩、拜城野生紫花苜蓿與獵人河、拜城野生紫花苜蓿與大西洋、拜城野生紫花苜蓿與蘭杰蘭德(GS=0.700)。公農(nóng)2號(hào)和牧歌401+Z間的相似系數(shù)最大(GS=1.000)，親緣關(guān)系最近，用3種同工酶不能區(qū)分其遺傳差異。栽培品種間的相似系數(shù)介于0.767～1.000，平均值為0.883，有183對(duì)栽培品種間的相似系數(shù)大于或等于0.900，親緣關(guān)系較近，表明苜蓿栽培品種間的遺傳相似性相對(duì)較高。406對(duì)材料中有47對(duì)材料間相似系數(shù)低于0.767，其中有6對(duì)材料為栽培品種，表明仍有部分苜蓿栽培品種間存在較明顯的遺傳差異性。隴東野生紫花苜蓿與拜城野生紫花苜蓿之間的相似系數(shù)為0.733，隴東野生紫花苜蓿與栽培品種間的相似系數(shù)介于0.633～0.833，平均值為0.749，拜城野生紫花苜蓿與栽培品種間的相似系數(shù)介于0.667～0.867，平均值為0.772。以上結(jié)果表明,野生種質(zhì)資源之間以及野生種質(zhì)資源與栽培品種之間存在著明顯的遺傳差異和較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。

2.3 供試材料的聚類分析

用NTSYSpc 2.1軟件對(duì)29份苜蓿材料進(jìn)行聚類分析，繪出樹狀聚類圖(圖4)。結(jié)果表明，29份苜蓿材料在相似系數(shù)為0.772處可聚為3類，第Ⅰ類由隴東野生紫花苜蓿組成；第Ⅱ類由拜城野生紫花苜蓿組成；第Ⅲ類由27份栽培苜蓿品種組成，在相似系數(shù)為0.863處聚為3個(gè)亞類，第Ⅰ亞類包括隴東苜蓿、Pick8925、公農(nóng)2號(hào)、牧歌401+Z、領(lǐng)先者、維多利亞、獵人河、IS-1044、波蘭、甘農(nóng)4號(hào)、德國(guó)大葉、中苜1號(hào)、會(huì)寧、甘農(nóng)1號(hào)、敖德薩、美國(guó)放牧型、美國(guó)苜蓿王、渭南，第Ⅱ亞類包括Pick 3006、皇后、北極星、安格、名流、堪利普、普列洛夫卡、大西洋，第Ⅲ亞類為蘭杰蘭德紫花苜蓿。

2.4 供試苜蓿材料的主成分分析

通過(guò)NTSYSpc 2.1軟件，對(duì)供試材料進(jìn)行主成分分析，并根據(jù)第1、第2主成分作圖，形成各苜蓿材料的位置分布圖(圖5)，圖中材料間位置相互靠近者表示親緣關(guān)系較近，遠(yuǎn)離者表示親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？梢钥闯?，拜城野生紫花苜蓿和隴東野生紫花苜蓿與栽培品種間的位置較遠(yuǎn)，表明野生種質(zhì)資源與栽培品種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。大西洋、蘭杰蘭德和渭南紫花苜蓿在圖中的位置也相對(duì)孤立，表現(xiàn)出與其他材料間較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。大部分栽培品種在圖中分布于同一區(qū)域，表明栽培品種之間的親緣關(guān)系較近。主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本相同。

圖4 29份苜蓿材料基于3種同工酶的聚類分析圖

圖5 29份苜蓿材料基于3種同工酶的主成分分析圖

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)選用了3種同工酶對(duì)29份苜蓿材料進(jìn)行了分析，共檢測(cè)到了30條酶帶，其中6條為特異酶帶，出現(xiàn)在隴東野生紫花苜蓿、拜城野生紫花苜蓿、蘭杰蘭德和大西洋紫花苜蓿的酶譜中。同工酶是不同基因編碼的蛋白質(zhì)，是基因的直接產(chǎn)物[28]。因此，特異酶帶是供試苜蓿材料遺傳特異性的表現(xiàn)。多態(tài)性酶帶數(shù)和百分率可以直接反映材料的多態(tài)性，間接反映酶譜的多樣性信息含量，還可作為度量遺傳變異水平高低的指標(biāo)[29]。本研究表明，過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和淀粉酶的多態(tài)位點(diǎn)百分率分別為75.00%、55.56%和33.33%，表明供試材料具有一定的變異水平，用同工酶分析苜蓿遺傳多樣性時(shí)，過(guò)氧化物酶效果最佳，過(guò)氧化氫酶次之，然后是淀粉酶。馬向麗和畢玉芬[22]對(duì)云南野生和逸生苜蓿資源過(guò)氧化物酶和酯酶同工酶進(jìn)行了分析，過(guò)氧化物酶共檢測(cè)到10條酶帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%。李景欣等[30]對(duì)新品系Dy-2006、龍牧801、中苜1號(hào)和肇東苜蓿的酯酶和過(guò)氧化物酶進(jìn)行了分析，其中過(guò)氧化物酶檢測(cè)到了13條酶帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%。尹權(quán)為等[31]采用過(guò)氧化物同工酶對(duì)12個(gè)紫花苜蓿品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，過(guò)氧化物酶檢測(cè)到了9條酶帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率為66.70%。由于各研究所選材料不同，所得酶帶數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率都不盡相同，但這些研究均證明過(guò)氧化物同工酶多態(tài)位點(diǎn)百分率較高，在苜蓿遺傳多樣性分析中具有良好的適用性。

29份苜蓿材料間的相似系數(shù)介于0.633～1.000，相似系數(shù)變幅較大，主要是由于野生種質(zhì)資源與栽培品種之間遺傳差異較大所致。野生種質(zhì)資源經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇，保持了較為豐富的遺傳多樣性和適應(yīng)性，往往蘊(yùn)涵著育種所需要的特殊基因資源[32]。本研究表明，隴東野生紫花苜蓿與拜城野生紫花苜蓿之間相似系數(shù)為0.733，相似系數(shù)相對(duì)較小，這與關(guān)瀟[33]用SRAP標(biāo)記對(duì)15個(gè)國(guó)家42份野生紫花苜蓿種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究結(jié)果相似。隴東野生紫花苜蓿與栽培品種間的相似系數(shù)平均值為0.749，拜城野生紫花苜蓿與栽培品種間的相似系數(shù)平均值為0.772，這些值都遠(yuǎn)小于栽培品種間的平均相似系數(shù)(0.883)，聚類分析結(jié)果也顯示，兩份野生紫花苜蓿分別被聚在兩個(gè)單獨(dú)的類中，在主成分分析圖中，兩份野生紫花苜蓿與其他材料間位置較遠(yuǎn)，表明野生種質(zhì)資源之間，以及野生種質(zhì)資源與栽培品種之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?？赏ㄟ^(guò)雜交、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)基因等育種手段實(shí)現(xiàn)資源有利基因的結(jié)合，培育新品種。同時(shí)，由于隴東野生紫花苜蓿和拜城野生紫花苜蓿具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，可以通過(guò)鑒定、篩選、作為野生栽培品種利用，或通過(guò)馴化、選擇和改良，轉(zhuǎn)化為栽培品種[34]，以擴(kuò)大苜蓿栽培品種的遺傳基礎(chǔ)。

27份苜蓿栽培品種間的相似系數(shù)介于0.767～1.000，平均值為0.883，其中有183對(duì)栽培品種間的相似系數(shù)大于或等于0.900。這與李景欣等[35]利用SSR標(biāo)記對(duì)苜蓿新品系Dy-2006等6個(gè)苜蓿品種(品系)親緣關(guān)系的研究結(jié)果相近。聚類分析把29份苜蓿材料在相似系數(shù)為0.722處聚為3類，栽培苜蓿品種全部聚在同一類中，在主成分分析圖中，大部分栽培品種間的位置也相對(duì)較近，表現(xiàn)出彼此之間較近的親緣關(guān)系。這表明，總體上栽培品種間的相似系數(shù)較大，親緣關(guān)系較近。育種實(shí)踐表明，種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的寬窄、遺傳多樣性的豐富程度、親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近是育種成敗的關(guān)鍵[34]。隨著苜蓿品種遺傳資源的日益枯竭，要在育種領(lǐng)域有所突破，一方面要重視挖掘野生種質(zhì)資源、地方種質(zhì)資源及具有特異優(yōu)良基因的種質(zhì)資源，引進(jìn)和利用國(guó)外優(yōu)良品種，盡量拓寬苜蓿育種材料的遺傳基礎(chǔ)；另一方面可通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交打破種間界限，擴(kuò)大基因組合范圍，創(chuàng)造新品種。李飛飛等[18]用15對(duì)SSR引物和10個(gè)ISSR引物對(duì)黃花苜蓿、多變苜蓿及紫花苜蓿共10個(gè)居群的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，10個(gè)居群間的遺傳距離介于0.05～0.23，平均值為0.12。王赫等[36]用RAPD標(biāo)記對(duì)黃花苜蓿、紫花苜蓿和雜花苜蓿品種進(jìn)行了聚類分析，草原1號(hào)(雜化苜蓿)、草原3號(hào)(雜花苜蓿)、美國(guó)苜蓿王(紫花苜蓿)和達(dá)菲(黃花苜蓿)聚在同一類中。劉磊等[37]用ISSR標(biāo)記對(duì)胡盧巴(Trigonellafoenum-graecum)、扁蓿豆和黃花苜蓿間的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，供試材料間的相似系數(shù)介于0.86～0.92。劉磊等[38]用ISSR標(biāo)記研究了紫花苜蓿、黃花苜蓿和胡盧巴屬植物的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，紫花苜蓿、黃花苜蓿和胡盧巴種質(zhì)資源間的相似系數(shù)介于0.85～0.94，其中胡盧巴屬材料和紫花苜蓿材料間相似系數(shù)為0.85。這些結(jié)果都表明，紫花苜蓿、黃花苜蓿、雜花苜蓿、胡盧巴屬植物之間親緣關(guān)系較近。作為不同種、屬的植物，彼此間較近的親緣關(guān)系賦予了它們作為遠(yuǎn)緣雜交親本獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和開(kāi)發(fā)潛力。近60年來(lái)，育種工作者在苜蓿遠(yuǎn)緣雜交方面進(jìn)行了大量的研究和實(shí)踐，已培育出許多優(yōu)良品種，如甘農(nóng)1號(hào)、草原1號(hào)、草原2號(hào)、圖牧1號(hào)、新牧1號(hào)、龍牧801苜蓿、龍牧803苜蓿[39-40]。美國(guó)Sorensen等也用一年生蝸牛苜蓿(Medicagoscutellata)和多年生苜蓿為親本進(jìn)行雜交，育成了抗蟲苜蓿新品種[34]。近年來(lái)，生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，又為遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)注入了新的活力，與諸多植物資源一樣，遠(yuǎn)緣雜交也將成為克服苜蓿種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，引領(lǐng)苜蓿育種取得突破性進(jìn)展的新途徑。

29份苜蓿資源406對(duì)材料中，有47對(duì)材料間的相似系數(shù)小于0.767，表現(xiàn)出彼此之間相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，其中有6對(duì)材料為栽培品種，表明除了野生種質(zhì)資源具有遺傳特異性外，仍有部分栽培品種間存在相對(duì)明顯的遺傳差異。聚類分析表明，栽培品種在相似系數(shù)為0.863處聚為3個(gè)亞類，其中蘭杰蘭德紫花苜蓿單獨(dú)聚為一個(gè)亞類。在主成分分析圖中，隴東野生紫花苜蓿、拜城野生紫花苜蓿、蘭杰蘭德、大西洋、渭南等紫花苜蓿材料的位置相對(duì)孤立，表現(xiàn)出與其他材料間相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。目前，關(guān)于遺傳距離能否預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)的研究還存在爭(zhēng)議，但也有大量研究表明，親本的親緣關(guān)系與雜種優(yōu)勢(shì)存在一定的相關(guān)性[41-44]。在一定范圍內(nèi)，親本遺傳基礎(chǔ)差異越大，其后代的分離范圍就越廣泛，從而獲得優(yōu)良雜種后代個(gè)體的機(jī)會(huì)也就越多[34]。因此，在苜蓿育種實(shí)踐中應(yīng)盡量選擇這些與其他材料間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)且綜合農(nóng)藝性狀較好的材料為親本，由于其后代的遺傳基礎(chǔ)豐富，可能會(huì)獲得分離范圍較大的群體。如果不考慮材料的親緣關(guān)系，只根據(jù)農(nóng)藝性狀選配親本，苜蓿育成品種遺傳基礎(chǔ)將會(huì)日趨狹窄。

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(責(zé)任編輯 武艷培)

Genetic diversity analysis of wild and cultivated alfalfa germplasm resources by isozyme markers

CHEN Li-qiang1, SHI Shang-li2, MA Chun-hui3

(1.College of Animal Science, Tarim University, Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Group, Alaer 843300, China;2.Pratacultural College of Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;3.College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, China)

The genetic diversity of two wild alfalfa (Medicagosativa) accessions and 27 alfalfa cultivars were investigated using peroxidase, catalase and amylase isozyme polymorphism. A total of 30 stable bands were observed by three isozymes across 29 accessions, and six of which were specific bands which were only detected in Longdong wild alfalfa, Baicheng wild alfalfa, Langersteiner cultivar and Atlantic cultivar. The percentage of polymorphic bands (PPB) for peroxidase, catalase and amylase were 75.00%, 55.56% and 33.33%, respectively. The similarity coefficient among 29 accessions ranged from 0.633 to 1.000 and averaged at 0.867. Compared with the similarity coefficient values between wild alfalfa accessions and cultivars, the similarity coefficient values among cultivars were relatively higher. Cluster analysis indicated that 29 accessions can be divided into three defined groups at the similarity coefficient value of 0.772, and two wild alfalfa accessions were clustered in two independent groups, respectively. The position of Longdong wild alfalfa and Baicheng wild alfalfa in graph of principal component analysis was relatively isolated which suggest that wild alfalfa accessions had relatively distant genetic relationship with cultivars.

alfalfa; wild germplasm resources; cultivars; isozymes; genetic diversity

MA Chun-hui E-mail: chunhuima@126.com

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0481

2013-08-18 接受日期：2013-11-29

國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(HS201103)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃，新疆綠洲區(qū)優(yōu)質(zhì)牧草選育及生產(chǎn)利用技術(shù)集成與示范(2011BAD17B05-2)；農(nóng)業(yè)部全國(guó)畜牧總站“牧草種質(zhì)資源保種”項(xiàng)目

陳立強(qiáng)(1981-)，男，甘肅會(huì)寧人，講師，碩士，研究方向?yàn)槟敛莘N質(zhì)資源及遺傳育種。E-mail:clqdky@126.com

馬春暉(1966-)，男，新疆哈密人，教授，研究方向?yàn)槟敛萆a(chǎn)與加工。E-mail:chunhuima@126.com

S816;S551+.703

A

1001-0629(2014)06-1070-10*1