湖北恩施地區(qū)天然富硒植物中硒形態(tài)的HPLC-ICP-MS分析

米秀博，邵樹勛，湯 鋆，張 靜

(1.中國科學院地球化學研究所礦床地球化學國家重點實驗室，貴州 貴陽 550002； 2.中國科學院大學，北京 100049；3.浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310009; 4.中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650)

后生物生產層

湖北恩施地區(qū)天然富硒植物中硒形態(tài)的HPLC-ICP-MS分析

米秀博1,2，邵樹勛1，湯 鋆3，張 靜2,4

(1.中國科學院地球化學研究所礦床地球化學國家重點實驗室，貴州 貴陽 550002； 2.中國科學院大學，北京 100049；3.浙江省疾病預防控制中心，浙江 杭州 310009; 4.中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650)

湖北恩施是爆發(fā)過世界上首例人群硒中毒的高硒背景區(qū)，蘊藏有豐富的富硒植物資源，調查發(fā)現(xiàn)了大量的富硒、超富集硒植物，具有很好的開發(fā)利用前景。利用高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜聯(lián)用儀(HPLC-ICP-MS)對恩施魚塘壩硒礦區(qū)發(fā)育的醉魚草(Buddleialindleyana)、水芹菜(Oenanthejavanica)富硒植物進行了硒形態(tài)的分析研究。結果表明，醉魚草和水芹菜總硒含量分別高達531.4和213.1 μg·g-1，從中檢測出硒代胱氨酸(Secys2)、硒代蛋氨酸(SeMet)和無機硒Se(VI)3種形態(tài)硒，其中醉魚草的3種形態(tài)硒含量分別為14.2、26.2和221.2 μg·g-1，水芹菜的3種形態(tài)硒的含量分別為4.24、28.49和169.9 μg·g-1。說明這些富硒植物具有用于提取天然有機硒的重要開發(fā)利用價值。

富硒植物；HPLC-ICP-MS；總硒；有機硒；形態(tài)分析

硒是人體必需的微量元素，具有清除體內自由基，抗衰老、增強人體免疫力、拮抗重金屬毒性及防癌、抗癌等生物功能。補硒是預防和治療克山病、大骨節(jié)病等許多缺硒引起的疾病及防癌、抗癌的有效途徑[1]。世界上有40多個國家處于缺硒狀態(tài)，中國是世界上缺硒最嚴重的地區(qū)之一，全國低硒地區(qū)占全國總面積的72%[2]。由于低硒土壤地區(qū)出產的農作物含硒量低，不能滿足人體正常生理的需要，因此，國內外對富硒食品及保健品的需求非常旺盛，可利用富硒地區(qū)的富硒植物開發(fā)生產富硒食品及補硒添加劑。不同化學形態(tài)的硒，其安全性、生物功能性存在較大差異。動植物對硒的吸收不僅與總硒的含量而且與硒的形態(tài)關系密切，同時有機硒的補硒效果優(yōu)于無機硒[3]。近年來，硒與癌癥的關系是國際上非常關注的科學問題，已有研究表明，甲基硒半胱氨酸(MeSeCys)、γ-谷氨酰-甲基硒代半胱氨酸(γ-glutamyl-MeSeCys)是有效的抗癌硒化合物[4-6]，可利用富硒植物從中提取可能含有的MeSeCys、γ-glutamyl-MeSeCys等抗癌硒化合物。

湖北恩施是爆發(fā)過世界上首例人群硒中毒的地區(qū)，該區(qū)巖石、土壤中硒含量極高，還發(fā)現(xiàn)了世界上罕見的獨立硒礦床，富硒巖石風化土壤生長的大量野生植物遠比其他地區(qū)的植物富硒，調查發(fā)現(xiàn)了大量的富硒、超富集硒植物[7]，是提取有機硒的重要生物資源。為了查明湖北恩施野生富硒植物中的有機硒資源，指導當?shù)馗晃a品的開發(fā)，本研究采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術，對恩施高硒地區(qū)發(fā)育的典型富硒植物醉魚草(Buddleialindleyana)和水芹菜(Oenanthejavanica)中硒的形態(tài)進行分析，以期查明該區(qū)富硒植物中有機硒化合物類型及含量，進而指導當?shù)馗晃a品的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 采樣點的選擇

選擇恩施地區(qū)發(fā)生過嚴重人畜硒中毒的恩施市魚塘壩村和建始縣安樂井村為調查采樣地。魚塘壩地理位置30°20′16″ N、109°46′39″ E，是曾暴發(fā)過世界首例人群硒中毒事件的知名硒中毒村，中國唯一的獨立硒礦床就產在該地，極有利于富硒植物的生長。安樂井村地理位置30°34′41″ N、108°42′52″ E，水中硒含量高達200～400 μg·L-1[7]。調查采樣重點選擇石煤廢渣堆，礦區(qū)石煤層間水、泉水流過的水溝流域、石煤風化土壤耕地、含礦巖石風化層表土分布區(qū)等富硒生態(tài)景觀。

1.2 樣品采集和預處理

醉魚草又名一枝紅花，馬錢科醉魚草屬植物，為落葉灌木，植株高1～2 m，采集于魚塘壩礦渣堆。水芹菜屬傘形科水芹屬多年生宿根草本水生植物，別名水芹，直立或平臥的一年生草本，采集于安樂井附近水溝。

采集的樣品先用自來水清洗干凈附著的泥土、灰塵之后，再用去離子水清洗3遍徹底將樣品清洗干凈，并在40～50 ℃條件下進行低溫烘干，用植物碎樣機粉碎并過0.25 mm篩，最后密封于聚乙烯塑料樣品袋中并儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.3 儀器和試劑

電感耦合等離子體質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，碰撞反應池模式(CCT)，H2作為碰撞氣體；粉碎機；烘箱；離心機；超聲儀；高效液相色譜儀(美國waters公司)，配waters 717 plus自動進樣設備；高效液相色譜柱與ICP-MS霧化器用0.25 mmPEEK管連接；HPLC-ICP-MS儀器參數(shù):HPLC柱型為Hamiltion PRP-X100陰離子柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)，流動相為5 mmol·L-1檸檬酸pH 4.69，流速1.2 mL·min-1，進樣量50 μL；ICP-MS射頻功率為1 300 W，駐留時間20 ms，測量同位素為78Se，采用碰撞反應池模式：碰撞氣8% H2/92% He，碰撞氣流速6.95 mL·min-1。

試驗中用水均為超純水(Sartorius，德國，18.2 MΩ)，濃硝酸(優(yōu)級純，體積分數(shù)65%～68%，國藥集團)，高氯酸(優(yōu)級純，70%～72%，上海桃浦化工廠)；試驗常用試劑：甲醇(色譜純，德國Merck公司)，檸檬酸、氨水均為分析純；鏈霉蛋白酶E：(Roche，德國)，4 ℃保存；Se元素標準溶液：濃度100 mg·L-1，用3% HNO3配置成含Se元素為1.0、5.0、10.0、20.0 μg·L-1的標準溶液。

硒標準品：硒代胱氨酸(SeCys2，純度98%，Aldrich)，甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys，純度≥95%，Sigma)，硒代蛋氨酸(SeMet，純度99%，Sigma)，亞硒酸鈉[Se(IV)，Na2SO3，純度≥98%，Sigma]，硒酸鈉[Se(VI)，Na2SO4，純度>98%，Sigma]；用0.1 mol·L-1HCl稀釋配置成1 mg·L-1的單標和混標標準儲備溶液，4 ℃保存。

1.4 試驗程序

總硒測定預處理:利用酸消解法[7]對植物樣品進行預處理；稱取經過處理的植物粉末樣品0.05 g(精確至0.000 1 g)左右，加入8 mL硝酸和0.5 mL高氯酸，蓋上器皿隔夜放置，同時做3份空白和平行樣。次日在電熱板上加熱消解，溫度為150 ℃左右。至溶液變?yōu)槌吻鍩o色并伴有白煙出現(xiàn)時，結束消解冷卻，用超純水定容稀釋，利用ICP-MS測定總硒含量。

植物中硒形態(tài)的分離分析:在形態(tài)分析的過程中采用酶解法提取，同時以超聲輔助消解，這大大縮短了提取時間；同時參照程建中測量富硒竹筍的提取方法[8]，具體操作：稱取0.10(精確至0.000 1 g)經處理的粉末樣品放入離心管，20 mg鏈蛋白酶溶于3 mL超純水加入到離心管，37 ℃超聲提取30 min，然后在14 000 r·min-1離心15 min，取上清液并定容至100 mL。進行HPLC-ICP-MS測定前樣品溶液過0.22 μm濾膜濾兩次。結合文獻[9-10]并利用上述HPLC-ICP-MS的工作條件，對100 μg·L-1的混合標樣進行分離。將樣品所測的硒形態(tài)總和與利用酸消解法得到的總硒含量進行對比，進而得到酶提取效率。

2 結果和討論

2.1 總硒

以含Se元素為0、1.0、5.0、10.0和20.0 μg·L-1的標準溶液做標準曲線，以10 μg·L-1Y、In、Bi為內標進行測定，結果表明，所測元素線性良好，相關系數(shù)為0.999 4。醉魚草和水芹菜中總硒的含量分別為531.4和213.1 μg·g-1(表1)，這與已報道人工培養(yǎng)的富硒南瓜種子1.1 μg·g-1[11]、富硒大米0.136～0.143 μg·g-1[12]、富硒大蒜蒜頭0.200～0.834 μg·g-1[13]相比，其含量高達百倍甚至千倍之多；這是由于植物發(fā)育于高硒環(huán)境下，對硒具有極強的耐受性，其富硒能力是普通植物經過短期硒處理不能達到的。所以，發(fā)育于高硒環(huán)境下的當?shù)刂参飸撟鳛楦晃a品開發(fā)的首選。

表1 富硒植物中的硒含量及其酶提取效率

注: *和**表示兩個樣品間差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。

Note: * and ** mean significant difference between two samples at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.2 硒的形態(tài)分析

5種標準樣品的分離結果依次為SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)，保留時間分別約為1.8、2.3、3.0、4.4、10.8 min(圖1)。

通過與標準圖譜(圖1A)對比可以發(fā)現(xiàn)，在醉魚草和水芹菜中均檢測到了SeCys2、SeMet、Se(VI)(圖1B、C)。根據(jù)各形態(tài)硒對應峰面積利用外標法進行硒形態(tài)含量的計算，不同植物樣品酶解法的提取效率不盡相同(表1)：水芹菜的提取效率超過85%，但是醉魚草的酶提取效率只有約45%。這可能是因為提取效率不但取決于提取方法同時也與樣品本身有很大關系[14-15]。

對于不同形態(tài)的硒含量，Se(VI)在醉魚草和水芹菜中都特別高，分別為221.2和169.9 μg·g-1，且兩者達到顯著差異(P<0.05)(表1)；這可能是由于土壤中存在Se(VI)，以及富硒植物特殊的富硒機理共同作用導致了所研究樣品中Se(VI)含量差異顯著[13,16-19]。值得注意的是，對人們健康特別重要的有機硒含量均比較可觀，在醉魚草和水芹菜中，有機硒Secys2的含量分別是14.2和4.2 μg·g-1，二者差異極顯著(P<0.01)；SeMet的含量分別是26.2和28.4 μg·g-1，二者無顯著差異(P>0.05)。與已報道的富硒產品富硒蘿卜(Secys2為5.9 μg·g-1、SeMet為18.1 μg·g-1)[20]、富硒大蒜(Secys2為6.1 μg·g-1、SeMet為15.8 μg·g-1)[21]、富硒洋蔥(Secys2為0.6 μg·g-1、 SeMet為1.2 μg·g-1)[22]對應的有機硒相比，本研究中兩種植物有機硒的含量明顯高。因此，如果經過處理，其會具有很高的利用價值；此外注意到，未檢測到的硒化物的含量也比較高，在醉魚草中達到一半之多，這可能是由于提取效率不足、標樣有限以及試驗方法的局限性等緣故而導致無法對未知硒化物進行分析，因此，對于這方面的深入研究也將會是以后工作的重點。

圖1 標樣及其樣品色譜對比圖

注:圖中A為100 μg·L-1混標樣的陰離子柱HPLC-ICP-MS標準圖譜;峰1為SeCys2、峰2為MeSeCys、峰3為Se(IV)、峰4為SeMet、峰5為Se(VI)，B、C分別為醉魚草和水芹菜酶提取液的色譜圖。

Note:A，a mixture of selenium species containing 100 μg·L-1separately； Peak 1,SeCys2;Peak 2，MeSeCys;Peak 3，Se(IV);Peak 4，SeMet;Peak 5，Se(VI); B，Buddleialindleyana; C，Oenanthejavanica.

3 結論

在恩施富硒地區(qū)魚塘壩和安樂井發(fā)育的富硒的醉魚草和水芹菜，其總硒含量分別為531.4和213.1 μg·g-1，主要的形態(tài)有硒代胱氨酸(Secys2)、硒代蛋氨酸(SeMet)和無機硒Se(VI)，且有機硒Secys2、SeMet的含量分別達14.2、4.24和26.2、28.4 μg·g-1，遠比一般市場上流行的富硒大米(0.136～0.143 μg·g-1)[10]、富硒茶(2.743 μg·g-1)[23]等富硒食品含量高，具有開發(fā)提取有機硒的重要價值，而且未知硒化物的深入研究將會使得這些富硒資源的應用前景更加廣闊。

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(責任編輯 武艷培)

Identification and characterization of selenium species in Se-enriched plants by HPLC-ICP-MS in Enshi

MI Xiu-bo1,2, SHAO Shu-xun1, TANG Jun3, ZHANG Jing2,4

(1.The State Key Laboratory of Ore Deposit Geochemistry, Institute of Geochemistry,Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China;2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 10049, China;3.Zhejiang Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310009, China;4.South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

The Yutangba Se-rich independent deposit is abundant in Se-enriched biological resources. The Se-enriched plants were collected in its natural seleniferous habitat and their Se distribution and speciation in all organs were tested using HPLC-ICP-MS. The highest Se accumulation of 531 μg·g-1was observed inBuddleialindleyanabased on total Se measurements. Speciation studies revealed that bothB.lindleyanaandOenanthejavanicahave three predominant form of Se which were SeCys2, SeMet and Se(VI) with concentration of 13.5, 24.2, 202.1 and 4.2, 25.4, 158.6 μg·g-1, respectively. The total selenium content was more than one hundred times compared with the artificial cultivation of Se-enriched products (Se-enriched garlic, Se-rich rice and Se-enriched pumpkin seeds, etc.). This will spark interest in increasing and/or modifying the Se compounds in plants.

Se-rich plant; HPLC-ICP-MS; total Se; organic selenium; speciation

SHAO Shu-xun E-mail:shaoshuxun@vip.gyig.ac.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2013-0436

2013-08-02 接受日期：2013-10-23

國家自然科學基金(40971287)

米秀博 (1990-)，男，甘肅慶陽人，碩士，主要從事環(huán)境地球化學研究。E-mail:mixiubo11@mails.ucas.ac.cn

邵樹勛 (1964-)，男，甘肅隴西人，副研究員，博士，主要從事環(huán)境地球化學研究。E-mail:shaoshuxun@vip.gyig.ac.cn

O613.52;TS255.7

A

1001-0629(2014)06-1173-05*1