αA晶體蛋白基因啟動子與HSP70融合基因?qū)Υ笫蟀肴樘切园變?nèi)障的抑制作用

張子萍，葛正龍

(遵義醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室，貴州 遵義 563099)

白內(nèi)障是目前世界上主要的致盲性眼病。在老年人中的發(fā)病率較高,其主要表現(xiàn)為晶狀體的混濁。到目前為止，還無延緩白內(nèi)障發(fā)生的有效方法，只有成熟時采取手術治療[1]。探索有效的方法抑制白內(nèi)障發(fā)生非常有必要。

αA-晶體蛋白是晶體上皮細胞的特異表達蛋白，有分子伴侶活性，可與蛋白質(zhì)結合，保護它們免受進一步的變性和降解，并能使聚集的蛋白質(zhì)解聚,從而保證晶狀體正常的透光度。晶狀體中α-晶體蛋白量隨著年齡增長會逐漸減少，使相應的分子伴侶功能下降，導致白內(nèi)障形成。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是目前公認的蛋白保護因子，有分子伴侶功能。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是其重要成員之一，對保護晶狀體的透明性有著重要的作用[2]。因此，本實驗研究αA晶體蛋白組織特異性啟動子(αACP)驅(qū)動的HSP70基因?qū)Υ笫蟀肴樘切园變?nèi)障形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-HSP70、pαACP-HSP70 (本室已構建)；多價陽離子脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000，美國Invotrogen公司)；D-半乳糖(張家港市思普生化有限公司)配成50%注射液,常規(guī)滅菌后使用；復方托吡卡胺滴眼液(參天制藥株式會社),供鏡檢前擴瞳用。

1.2 主要儀器 裂隙燈顯微鏡(蘇州醫(yī)療器械廠)，熒光顯微鏡(德國Leica公司)等。

1.3 實驗動物 3周齡SD大鼠160只，平均體重(50±5) g，健康，無眼疾，雌雄不拘(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥方法[3]將160只SD大鼠隨機分成5組，每組32只。分別為：①NS組(陰性對照)；②半乳糖+ Lipo-pαACP-HSP70組(簡寫為半乳糖+α-70組)；③半乳糖+Lipo-pIRES2-EGFP-HSP70組(簡寫為半乳糖+ HSP70組)；④半乳糖+ Lipo-pIRES2-EGFP組(簡寫為半乳糖+EGFP組)；⑤半乳糖+NS組(陽性對照)。第1步：②③④⑤組頸背部皮下注射質(zhì)量分數(shù)為50%的D-半乳糖(30mL·kg-1·d-1)，連續(xù)30d。第2步：注射半乳糖4h后，分別為①②③④⑤組單側(cè)眼球球后注射0.9%NS、Lipo-pαACP-HSP70混合液、Lipo-pIRES2-EGFP-HSP70混合液、Lipo-pIRES2-EGFP混合液、0.9%NS 0.1 m L/只，隔日1次，連續(xù)15次。各種藥液注射后均需留針30s以防藥液從針眼處滲漏(注：第1步與第2步同時進行)。

在第1次給藥后7、14、21和30 d隨機處死8只大鼠，摘除眼球，分離出晶狀體。

1.4.2 LipofectamineTM2000/質(zhì)粒復合液制備 按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說明書，將脂質(zhì)體與質(zhì)粒(pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-HSP70、pαACP-HSP70)分別用0.9%NS稀釋，脂質(zhì)體與質(zhì)粒比例為3μL:1μg，混勻靜置，制備濃度為3μg/μL的脂質(zhì)體/質(zhì)粒復合物(Lipo-pIRES2-EGFP、Lipo-pIRES2-EGFP-HSP70、Lipo-pαACP-HSP70)。

1.4.3 晶狀體混濁度觀察 從第1次給藥后第3d開始，每日在裂隙燈顯微鏡下觀察各組大鼠的晶狀體混濁情況。參照Kador等[4]的分級標準將晶狀體混濁度分為5級，I級：晶狀體透明，無混濁；II級：晶狀體輕度渾濁,周邊出現(xiàn)空泡或線狀改變；Ⅲ級：晶狀體周邊空泡向中心擴展，出現(xiàn)霧狀混濁為中度混濁；1V級：晶狀體高度渾濁,空泡擴展到核區(qū),中心核霧狀渾濁加重；V級：核混濁，白內(nèi)障成熟。記錄結果并照相。

1.4.4 熒光顯微鏡下觀察 制作冰凍切片，通過觀察熒光強度了解pαACP-HSP70中EGFP基因在晶狀體上皮細胞的表達情況,以平均熒光強度代表蛋白表達水平。

2 結果

2.1 晶狀體混濁度檢查(見表1～4) ①NS組：在整個實驗過程未出現(xiàn)晶狀體混濁(見表1,圖1)；②半乳糖+NS組：第7天見94%晶狀體出現(xiàn)空泡Ⅱ級及以上改變(見表1)；第14天時88%晶狀體出現(xiàn)Ⅲ級及以上改變(見表2)；第21天時94%大鼠晶狀體出現(xiàn)Ⅳ級及以上改變(見表3)；第30天時100%大鼠晶狀體出現(xiàn)V級改變(見表4, 圖1B,圖2)；③半乳糖+EGFP組白內(nèi)障出現(xiàn)的時間、程度與同期的半乳糖組+NS相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1～4,圖1)；④半乳糖+HSP70組：在第7天時84%晶狀體出現(xiàn)Ⅱ級及以上改變(見表1)；第14天時79%晶狀體出現(xiàn)Ⅲ級以上改變(見表2)；第21天時38%晶狀體出現(xiàn)IV級及以上變化(見表3)，第30天時25%晶狀體出現(xiàn)V級改變(見表4)，⑤半乳糖+α-70組在第7天時只有59%晶狀體出現(xiàn)Ⅱ級及以上改變(見表1)；第14天時46%晶狀體出現(xiàn)Ⅲ級以上改變(見表2)；第21天時19%晶狀體出現(xiàn)IV級及以上改變(見表3)，第30天時只有約13%晶狀體出現(xiàn)V級改變 (見表4)，該組白內(nèi)障出現(xiàn)的程度與同期的半乳糖+NS組、半乳糖+EGFP組及半乳糖+HSP70組相比明顯減輕(P<0.05)，并且其所出現(xiàn)白內(nèi)障的時間亦延遲。

表1實驗第7天裂隙燈下各組大鼠晶狀體混濁度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組BC320000半乳糖+α-70組AC1319000半乳糖+HSP70組AB527000半乳糖+EGFP組ABD427100半乳糖+NS組ABD228200

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，DP>0.05。

表2實驗第14天裂隙燈下各組大鼠晶狀體混濁度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組 BC240000半乳糖+α-70組 AC0131010半乳糖+HSP70組AB051810半乳糖+EGFP組ABD022020半乳糖+NS組ABD031920

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，DP>0.05。

表3實驗第21天裂隙燈下各組大鼠晶狀體混濁度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組BCE160000半乳糖+α-70組ACE07630半乳糖+HSP70組ABE02860半乳糖+EGFP組ABC003130半乳糖+NS組ABCF001123

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，與半乳糖+EGFP組比較，EP<0.05，F(xiàn)P>0.05。

表4實驗第30天各組大鼠晶狀體混濁程度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組 BCE80000半乳糖+α-70組 ACE00431半乳糖+HSP70組ABE00152半乳糖+EGFP組ABC00017半乳糖+NS組ABCF00008

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，與半乳糖+EGFP組比較，EP<0.05，F(xiàn)P>0.05。

2.2 外源基因表達的綠色熒光蛋白鑒定 NS組與半乳糖+NS組未見綠色熒光蛋白表達(圖2A)；半乳糖+α-70組(圖2B)、半乳糖+HSP70(圖2C)、半乳糖+EGFP組(2D)均可直接觀察到大鼠晶狀體上皮細胞中有綠色熒光，只是熒光強度不同。綠色熒光的平均熒光強度利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測得(見表5)，半乳糖+α-70組的平均熒光強度最強，與其他4組相比有明顯差異(P<0.01)；半乳糖+EGFP組與半乳糖+HSP70組相比無明顯差異(P>0.05)；NS組與半乳糖+NS組相比無明顯差異(P>0.05)，這兩組幾乎沒有綠色熒光，所測得的平均熒光強度都為0，明顯低于其他3組(P<0.01)。

時間(d)NS組 半乳糖+α-70組半乳糖+ HSP70組半乳糖+ EGFP組半乳糖+NS組70cd35.19±4.87ad14.63±3.98ace17.75±4.99ac0bcd140cd77.01±7.53ad36.12±5.11ace31.12±7.23ac0bcd210cd102.45±9.45ad 54.43±6.39ace51.80±5.82ac0bcd300cd140.91±12.41ad75.45±6.46ace72.58±7.11ac0bcd

注：與NS組比較，aP<0.01，bP>0.05；與半乳糖+ α-70組比較，cP<0.01；與半乳糖+EGFP 組比較，dP<0.01，eP>0.05。

注：A、B、C、D、E分別表示NS組、半乳糖+α-70組、半乳糖+HSP70組、半乳糖+EGFP組、半乳糖+NS組；1、2、3、4分別表示第7、14、21、30 d。 圖1 裂隙燈觀察晶狀體混濁度的主要變化

注：A:為NS組和半乳糖+NS組；B:為半乳糖+α-70組、C:為半乳糖+HSP70組、D:為半乳糖+EGFP組。 圖2 第30天時熒光顯微鏡下觀察結果(×100)

3 討論

白內(nèi)障表現(xiàn)為晶狀體特定的區(qū)域或完全的混濁化[5]。維持晶狀體的透明度對保護視功能有重大意義。晶狀體比較特殊，無血管，無神經(jīng)，只能從周圍的房水中攝取營養(yǎng)物質(zhì)，因此,不利于環(huán)境對其進行有效的調(diào)整,容易遭到損害。αA晶體蛋白僅局限于晶狀體內(nèi)表達，其它組織僅有少量被發(fā)現(xiàn)[6]。

研究表明，晶狀體中α-晶體蛋白含量隨著年齡增長會逐漸減少，高相對分子量蛋白質(zhì)可能發(fā)生翻譯后修飾改變，構象發(fā)生改變后形成大量的α- 晶體蛋白聚合物，導致分子伴侶功能下降，對其他晶體蛋白和酶的保護作用也相應下降，加劇其他晶體蛋白的凝聚和光散射[7]，從而形成白內(nèi)障。也有研究表明，隨著年齡的增長，晶狀體囊膜中HSP含量逐漸減少，晶體上皮細胞HSP的表達量減少反映了晶狀體細胞自我修復功能的下降，可引起變性蛋白的恢復障礙和降解速度減慢，使晶狀體的透明度降低，從而導致老年性白內(nèi)障的形成，可見晶體上皮細胞內(nèi)起分子伴侶作用的物質(zhì)受損或降低也是導致白內(nèi)障發(fā)生的主要因素之一。HSP70是HSP其中一員，它在正常細胞中表達水平較低，而應激后表達會顯著性的增強。李桂榮等[8]等通過研究表明HSP70的應激表達對人晶狀體上皮細胞起著重要的保護作用。Massey等[9]研究表明外源基因?qū)胙蹆?nèi)后，可檢測到晶狀體內(nèi)有相應蛋白表達。因此，本研究小組在前期已構建了αA晶體蛋白基因啟動子(αACP)與HSP70基因融合表達載體(即pαACP-HSP70)[10]，并將質(zhì)粒導入體外培養(yǎng)的半乳糖性白內(nèi)障大鼠晶狀體組織中，結果顯示外源性pαACP-HSP70在體外培養(yǎng)的大鼠晶狀體內(nèi)有表達，及其對大鼠半乳糖性白內(nèi)障的形成有延緩作用。本實驗從體外研究進一步發(fā)展到體內(nèi)研究，將質(zhì)粒導入半乳糖性白內(nèi)障大鼠體內(nèi)，結果顯示裂隙燈觀察半乳糖+α-70組與半乳糖+HSP70組白內(nèi)障出現(xiàn)的時間與其他組相比明顯延遲，測得的平均熒光強度也比其他組高(P<0.05)，且半乳糖+α-70組比半乳糖+HSP70組程度更輕，半乳糖+α-70組平均熒光強度最強。之所以半乳糖+α-70組比半乳糖+HSP70組作用明顯。我們推測可能的原因是：由于pαACP-HSP70中含有αA晶體蛋白基因啟動子，它能夠促進其下游的HSP70定向的表達，從而使HSP70含量增加。證明外源HSP70已定向在大鼠晶狀體上皮細胞內(nèi)有表達，并且發(fā)揮了其分子伴侶的功能，能防止蛋白質(zhì)變性和降解，并能使聚集的蛋白質(zhì)解聚,從而保證了晶狀體的透明度，延緩了大鼠半乳糖性白內(nèi)障的形成。

白內(nèi)障是當今世界致盲的主要眼病。國內(nèi)外學者正在積極探索治療白內(nèi)障的有效方法。隨著科學技術的快速發(fā)展，白內(nèi)障的基因治療已受到人們的重視，經(jīng)過不懈的努力,我們發(fā)現(xiàn)HSP70有阻止晶狀體上皮細胞凋亡的作用，同時在保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面也起著重要作用。采用基因治療的方法，通過導入外源的HSP70或誘導自身HSP70基因表達，從而抑制白內(nèi)障形成，這為治療白內(nèi)障提供新的研究方法和思路。

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