響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取靈芝多糖工藝條件

呂興萍+楊薇紅+馬春嬌

摘要：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用提取時(shí)間、提取溫度、酶量3個(gè)反應(yīng)因素作為研究對(duì)象，以多糖提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化靈芝多糖的提取工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取條件為提取溫度51 ℃、酶量180%、提取時(shí)間2.5 h。在最佳工藝條件下，多糖提取率可達(dá)11.25%。

關(guān)鍵詞：靈芝多糖；酶法提取；響應(yīng)面分析

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技項(xiàng)目（編號(hào)：2010c09）。

作者簡(jiǎn)介：呂興萍（1981—），女，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事中藥新劑型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱(chēng)，具有扶正固本等功效。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等廣泛的藥理活性[1-5]，因此靈芝多糖是目前靈芝研究的熱點(diǎn)之一。目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統(tǒng)的水提醇沉法，此外還有膜分離法、酶解法、超聲法、微波法等。其中，酶解法通過(guò)酶解破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)強(qiáng)化有效成分的傳質(zhì)過(guò)程，較大幅度提高多糖得率，不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)和生物活性[6]。響應(yīng)面法以最經(jīng)濟(jì)的方式、較少的試驗(yàn)次數(shù)和較短的時(shí)間對(duì)所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究[7]。本試驗(yàn)擬采取酶解法提取靈芝多糖，以靈芝多糖提取率響應(yīng)值為研究對(duì)象，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)靈芝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到靈芝多糖最佳提取工藝參數(shù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

HY-02型高速粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司），上海菁華754分光光度計(jì)，電子天平，HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)），SHZ-IIIB循環(huán)式多用真空泵（浙江省臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司）。

靈芝子實(shí)體（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌研究所）；纖維素酶（活性≥400 U/mg）；濃硫酸、苯酚、無(wú)水葡萄糖、乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1靈芝多糖的提取將干燥的靈芝切片在高速粉碎機(jī)下粉碎至一定粒度，精確稱(chēng)取0.25 g靈芝粉及適量的纖維素酶，加入純化水在一定溫度水浴下酶解提取后，在沸水浴中滅酶4 min，抽濾得靈芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的測(cè)定以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，并采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量，最后根據(jù)下式計(jì)算靈芝多糖提取率。

多糖提取率=（總糖量-還原糖量）/供試樣品量×100%。

1.2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合單因素影響多糖提取率的試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、酶量、提取時(shí)間3個(gè)因素，以靈芝多糖的提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對(duì)靈芝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，表2中試驗(yàn)1～12 為析因試驗(yàn)，13～17 為中心試驗(yàn)，17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在x1、x2、x3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。各因素經(jīng)回歸擬合后，

響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型分析結(jié)果

變異源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型項(xiàng)1.8170.26失擬度1.3130.443.480.129 7純誤差0.5040.13總變異20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

得回歸方程為：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明該響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬度P=0.129 7>0.05，說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果與模型計(jì)算結(jié)果沒(méi)有顯著差異。提取溫度、酶量、提取時(shí)間這3個(gè)因素的P值分別為0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，說(shuō)明這3個(gè)因素均對(duì)靈芝多糖提取率有顯著影響。對(duì)各個(gè)因素之間的交互作用進(jìn)行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，說(shuō)明各個(gè)因素之間的交互影響較小?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)r=0.954 0，說(shuō)明響應(yīng)值（提取率）的變化有9540%來(lái)源于所選變量（即提取溫度、提取時(shí)間和酶量）。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

為進(jìn)一步直觀(guān)說(shuō)明提取溫度、酶量和提取時(shí)間之間的交

互作用及其對(duì)多糖提取率的影響，用Design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖，通過(guò)考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析提取溫度、酶量、提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響。

多糖提取率在設(shè)定范圍內(nèi)隨提取

時(shí)間延長(zhǎng)而增大；而在設(shè)定的范圍內(nèi)，多糖提取率隨酶量和提取溫度增加均是上升后達(dá)到一個(gè)平衡，即最大值。從經(jīng)濟(jì)角度和提取的可行性考慮，將2.5 h定為最適提取時(shí)間，最佳提取酶量和提取溫度可以由上述方程求導(dǎo)得到，即靈芝多糖提取最佳工藝條件為提取溫度50.59 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，在該條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的靈芝多糖提取率的理論值為11.55%。

為了驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性，采用最優(yōu)提取條件浸提靈芝多糖，考慮到試驗(yàn)操作的可行性，為方便實(shí)際操作，將條件修正為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，在此條件下實(shí)際提取率11.25%，實(shí)際測(cè)定值比理論預(yù)測(cè)值（11.55%）低260%。由此可見(jiàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的浸提條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)，確定靈芝多糖的提取最佳工藝參數(shù)為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，按照此工藝提取靈芝多糖的提取率較高，實(shí)際提取率可達(dá)11.25%。

參考文獻(xiàn)：

[1]張志軍，李淑芳，魏雪生，等. 靈芝多糖體外抗氧化活性的研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黃智璇，歐陽(yáng)蒲月.靈芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李麗，雷林生，余傳林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干擾素 γ含量的變化及免疫調(diào)節(jié)藥物的干預(yù)作用[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（1）：65-68.

[4]李建軍，雷林生，余傳林，等. 靈芝多糖抗腫瘤作用的免疫學(xué)相關(guān)性研究[J]. 中藥材，2007，30（1）：71-73.

[5]吳鋒，孟國(guó)梁，楊麗云，等. 靈芝多糖預(yù)防大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 南通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，28（4）：251-252，255.

[6]李小平，陳錦屏. 油棗多糖的酶法提取及其對(duì)多糖分子量分布的影響[J]. 食品科學(xué)，2007，28（8）：191-194.

[7]王明艷，張小杰，王濤，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化香椿葉多糖的提取條件[J]. 食品科學(xué)，2010，31（4）：106-110.任冰如，陳劍，呂寒，等. 紅鳳菜總黃酮的富集方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：260-262.endprint

摘要：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用提取時(shí)間、提取溫度、酶量3個(gè)反應(yīng)因素作為研究對(duì)象，以多糖提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化靈芝多糖的提取工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取條件為提取溫度51 ℃、酶量180%、提取時(shí)間2.5 h。在最佳工藝條件下，多糖提取率可達(dá)11.25%。

關(guān)鍵詞：靈芝多糖；酶法提?。豁憫?yīng)面分析

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技項(xiàng)目（編號(hào)：2010c09）。

作者簡(jiǎn)介：呂興萍（1981—），女，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事中藥新劑型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱(chēng)，具有扶正固本等功效。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等廣泛的藥理活性[1-5]，因此靈芝多糖是目前靈芝研究的熱點(diǎn)之一。目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統(tǒng)的水提醇沉法，此外還有膜分離法、酶解法、超聲法、微波法等。其中，酶解法通過(guò)酶解破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)強(qiáng)化有效成分的傳質(zhì)過(guò)程，較大幅度提高多糖得率，不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)和生物活性[6]。響應(yīng)面法以最經(jīng)濟(jì)的方式、較少的試驗(yàn)次數(shù)和較短的時(shí)間對(duì)所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究[7]。本試驗(yàn)擬采取酶解法提取靈芝多糖，以靈芝多糖提取率響應(yīng)值為研究對(duì)象，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)靈芝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到靈芝多糖最佳提取工藝參數(shù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

HY-02型高速粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司），上海菁華754分光光度計(jì)，電子天平，HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)），SHZ-IIIB循環(huán)式多用真空泵（浙江省臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司）。

靈芝子實(shí)體（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌研究所）；纖維素酶（活性≥400 U/mg）；濃硫酸、苯酚、無(wú)水葡萄糖、乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1靈芝多糖的提取將干燥的靈芝切片在高速粉碎機(jī)下粉碎至一定粒度，精確稱(chēng)取0.25 g靈芝粉及適量的纖維素酶，加入純化水在一定溫度水浴下酶解提取后，在沸水浴中滅酶4 min，抽濾得靈芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的測(cè)定以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，并采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量，最后根據(jù)下式計(jì)算靈芝多糖提取率。

多糖提取率=（總糖量-還原糖量）/供試樣品量×100%。

1.2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合單因素影響多糖提取率的試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、酶量、提取時(shí)間3個(gè)因素，以靈芝多糖的提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對(duì)靈芝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，表2中試驗(yàn)1～12 為析因試驗(yàn)，13～17 為中心試驗(yàn)，17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在x1、x2、x3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。各因素經(jīng)回歸擬合后，

響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型分析結(jié)果

變異源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型項(xiàng)1.8170.26失擬度1.3130.443.480.129 7純誤差0.5040.13總變異20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

得回歸方程為：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明該響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬度P=0.129 7>0.05，說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果與模型計(jì)算結(jié)果沒(méi)有顯著差異。提取溫度、酶量、提取時(shí)間這3個(gè)因素的P值分別為0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，說(shuō)明這3個(gè)因素均對(duì)靈芝多糖提取率有顯著影響。對(duì)各個(gè)因素之間的交互作用進(jìn)行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，說(shuō)明各個(gè)因素之間的交互影響較小?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)r=0.954 0，說(shuō)明響應(yīng)值（提取率）的變化有9540%來(lái)源于所選變量（即提取溫度、提取時(shí)間和酶量）。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

為進(jìn)一步直觀(guān)說(shuō)明提取溫度、酶量和提取時(shí)間之間的交

互作用及其對(duì)多糖提取率的影響，用Design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖，通過(guò)考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析提取溫度、酶量、提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響。

多糖提取率在設(shè)定范圍內(nèi)隨提取

時(shí)間延長(zhǎng)而增大；而在設(shè)定的范圍內(nèi)，多糖提取率隨酶量和提取溫度增加均是上升后達(dá)到一個(gè)平衡，即最大值。從經(jīng)濟(jì)角度和提取的可行性考慮，將2.5 h定為最適提取時(shí)間，最佳提取酶量和提取溫度可以由上述方程求導(dǎo)得到，即靈芝多糖提取最佳工藝條件為提取溫度50.59 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，在該條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的靈芝多糖提取率的理論值為11.55%。

為了驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性，采用最優(yōu)提取條件浸提靈芝多糖，考慮到試驗(yàn)操作的可行性，為方便實(shí)際操作，將條件修正為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，在此條件下實(shí)際提取率11.25%，實(shí)際測(cè)定值比理論預(yù)測(cè)值（11.55%）低260%。由此可見(jiàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的浸提條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)，確定靈芝多糖的提取最佳工藝參數(shù)為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，按照此工藝提取靈芝多糖的提取率較高，實(shí)際提取率可達(dá)11.25%。

參考文獻(xiàn)：

[1]張志軍，李淑芳，魏雪生，等. 靈芝多糖體外抗氧化活性的研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2011，28（3）：63-65.

[2]黃智璇，歐陽(yáng)蒲月.靈芝多糖降血糖作用的研究[J]. 食用菌，2009，31（1）：60-61.

[3]李麗，雷林生，余傳林，等. 荷S-180移植瘤小鼠血清干擾素 γ含量的變化及免疫調(diào)節(jié)藥物的干預(yù)作用[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（1）：65-68.

[4]李建軍，雷林生，余傳林，等. 靈芝多糖抗腫瘤作用的免疫學(xué)相關(guān)性研究[J]. 中藥材，2007，30（1）：71-73.

[5]吳鋒，孟國(guó)梁，楊麗云，等. 靈芝多糖預(yù)防大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 南通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，28（4）：251-252，255.

[6]李小平，陳錦屏. 油棗多糖的酶法提取及其對(duì)多糖分子量分布的影響[J]. 食品科學(xué)，2007，28（8）：191-194.

[7]王明艷，張小杰，王濤，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化香椿葉多糖的提取條件[J]. 食品科學(xué)，2010，31（4）：106-110.任冰如，陳劍，呂寒，等. 紅鳳菜總黃酮的富集方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：260-262.endprint

摘要：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用提取時(shí)間、提取溫度、酶量3個(gè)反應(yīng)因素作為研究對(duì)象，以多糖提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化靈芝多糖的提取工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取條件為提取溫度51 ℃、酶量180%、提取時(shí)間2.5 h。在最佳工藝條件下，多糖提取率可達(dá)11.25%。

關(guān)鍵詞：靈芝多糖；酶法提??；響應(yīng)面分析

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）06-0258-02

收稿日期：2013-09-16

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技項(xiàng)目（編號(hào)：2010c09）。

作者簡(jiǎn)介：呂興萍（1981—），女，江蘇海安人，碩士，講師，主要從事中藥新劑型研究。E-mail：xingping8702007@sohu.com。靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱(chēng)，具有扶正固本等功效。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老以及活血化瘀等廣泛的藥理活性[1-5]，因此靈芝多糖是目前靈芝研究的熱點(diǎn)之一。目前靈芝多糖的提取方法主要是傳統(tǒng)的水提醇沉法，此外還有膜分離法、酶解法、超聲法、微波法等。其中，酶解法通過(guò)酶解破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)強(qiáng)化有效成分的傳質(zhì)過(guò)程，較大幅度提高多糖得率，不易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)和生物活性[6]。響應(yīng)面法以最經(jīng)濟(jì)的方式、較少的試驗(yàn)次數(shù)和較短的時(shí)間對(duì)所選的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究[7]。本試驗(yàn)擬采取酶解法提取靈芝多糖，以靈芝多糖提取率響應(yīng)值為研究對(duì)象，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)靈芝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到靈芝多糖最佳提取工藝參數(shù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

HY-02型高速粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司），上海菁華754分光光度計(jì)，電子天平，HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)），SHZ-IIIB循環(huán)式多用真空泵（浙江省臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司）。

靈芝子實(shí)體（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌研究所）；纖維素酶（活性≥400 U/mg）；濃硫酸、苯酚、無(wú)水葡萄糖、乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1靈芝多糖的提取將干燥的靈芝切片在高速粉碎機(jī)下粉碎至一定粒度，精確稱(chēng)取0.25 g靈芝粉及適量的纖維素酶，加入純化水在一定溫度水浴下酶解提取后，在沸水浴中滅酶4 min，抽濾得靈芝多糖提取液。

1.2.2多糖提取率的測(cè)定以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量，并采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量，最后根據(jù)下式計(jì)算靈芝多糖提取率。

多糖提取率=（總糖量-還原糖量）/供試樣品量×100%。

1.2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合單因素影響多糖提取率的試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、酶量、提取時(shí)間3個(gè)因素，以靈芝多糖的提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對(duì)靈芝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，表2中試驗(yàn)1～12 為析因試驗(yàn)，13～17 為中心試驗(yàn)，17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在x1、x2、x3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。各因素經(jīng)回歸擬合后，

響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型分析結(jié)果

變異源平方和自由度均方F值P值模型18.2992.037.870.006 3x13.3513.3512.990.008 7x22.6212.6210.160.015 3x36.8816.8826.660.001 3x1x20.4410.441.700.233 8x1x31.0811.084.170.080 6x2x30.2410.240.940.364 6x121.0711.074.130.081 7x222.2912.298.870.020 6x320.2810.281.080.334 2模型項(xiàng)1.8170.26失擬度1.3130.443.480.129 7純誤差0.5040.13總變異20.1016注：R2=0.910 1，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

得回歸方程為：y=10.33+0.65x1+0.57x2+0.93x3-0.33x1x2-0.52x1x3-0.25x2x3-0.50x12-0.74x22+0.26x32。

模型P=0.006 3<0.01，表明該響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬度P=0.129 7>0.05，說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果與模型計(jì)算結(jié)果沒(méi)有顯著差異。提取溫度、酶量、提取時(shí)間這3個(gè)因素的P值分別為0.008 7、0.015 3、0.001 3，均小于0.05，說(shuō)明這3個(gè)因素均對(duì)靈芝多糖提取率有顯著影響。對(duì)各個(gè)因素之間的交互作用進(jìn)行分析，x1x2、x1x3、x2x3的P值均大于 0.05，說(shuō)明各個(gè)因素之間的交互影響較小?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)r=0.954 0，說(shuō)明響應(yīng)值（提取率）的變化有9540%來(lái)源于所選變量（即提取溫度、提取時(shí)間和酶量）。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

為進(jìn)一步直觀(guān)說(shuō)明提取溫度、酶量和提取時(shí)間之間的交

互作用及其對(duì)多糖提取率的影響，用Design-expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖，通過(guò)考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析提取溫度、酶量、提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖提取率的影響。

多糖提取率在設(shè)定范圍內(nèi)隨提取

時(shí)間延長(zhǎng)而增大；而在設(shè)定的范圍內(nèi)，多糖提取率隨酶量和提取溫度增加均是上升后達(dá)到一個(gè)平衡，即最大值。從經(jīng)濟(jì)角度和提取的可行性考慮，將2.5 h定為最適提取時(shí)間，最佳提取酶量和提取溫度可以由上述方程求導(dǎo)得到，即靈芝多糖提取最佳工藝條件為提取溫度50.59 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，在該條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的靈芝多糖提取率的理論值為11.55%。

為了驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性，采用最優(yōu)提取條件浸提靈芝多糖，考慮到試驗(yàn)操作的可行性，為方便實(shí)際操作，將條件修正為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，在此條件下實(shí)際提取率11.25%，實(shí)際測(cè)定值比理論預(yù)測(cè)值（11.55%）低260%。由此可見(jiàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的浸提條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)，確定靈芝多糖的提取最佳工藝參數(shù)為提取溫度51 ℃、酶量1.80%、提取時(shí)間2.5 h，按照此工藝提取靈芝多糖的提取率較高，實(shí)際提取率可達(dá)11.25%。

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