潘有福

(新加坡國立癌癥中心轉(zhuǎn)化研究實驗室，新加坡 169612)

真核生物的染色體(質(zhì))在細(xì)胞核內(nèi)，存在著不同的構(gòu)象狀態(tài)。當(dāng)經(jīng)歷細(xì)胞分裂周期時，染色體呈現(xiàn)周期性的凝縮和去凝縮的過程。在間期的細(xì)胞核中，染色體也需要經(jīng)過盤繞折疊，形成一種復(fù)雜的動態(tài)的高級結(jié)構(gòu)。染色體一般以核小體作為基本的結(jié)構(gòu)單位。在人的細(xì)胞核中，核小體是由147個DNA堿基對，纏繞在盤狀的堿性組蛋白8聚體(H2A,H2B,H3,H4各2個)外圍而形成。核小體之間還有一段連接DNA, 與H1組蛋白結(jié)合。每一條染色質(zhì)線都是由眾多核小體組成。這種念珠狀的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過多重折疊，并依附于染色體骨架上，形成更緊密高級的結(jié)構(gòu)[1-2]。這種復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)解決了將大約2 m長的DNA-組蛋白復(fù)合物壓縮進(jìn)直徑約6μm的微小細(xì)胞核的組織結(jié)構(gòu)問題，但同時也對如何將以線性方式攜帶的遺傳信息在一定的時間和空間進(jìn)行恰當(dāng)表達(dá)提出了難題。因此了解染色體在細(xì)胞核內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)及拓?fù)渥兓?guī)律，以及這種結(jié)構(gòu)變化對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)控制，仍然是研究的熱點之一。

近年發(fā)展起來的各種研究染色質(zhì)相互作用的技術(shù)，尤其是染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)(Chromosome conformation capture，3C)，為我們研究染色體在細(xì)胞核中的三維構(gòu)象提供了有力的技術(shù)手段，利用3C及其衍生技術(shù)，我們可以獲得染色質(zhì)上不同部位，以及染色質(zhì)纖維之間在特定細(xì)胞狀態(tài)下的相互作用信息。通過分析這些信息，我們可以了解間期細(xì)胞核中的染色體分布狀態(tài)和特點，以及增強子和啟動子相互作用以調(diào)控基因表達(dá)的規(guī)律。本文介紹用于研究染色質(zhì)相互作用的技術(shù)，包括顯微觀察和3C及其衍生技術(shù)，回顧近年來利用相關(guān)技術(shù)取得的主要研究進(jìn)展，并對該技術(shù)的應(yīng)用前景作一討論。

1 顯微鏡觀察

染色體構(gòu)象的研究技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的顯微鏡觀察和近些年興起的3C等技術(shù)(見表1)。顯微鏡觀察主要是指熒光原位雜交(fuorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)。FISH技術(shù)通常利用熒光標(biāo)記的DNA或RNA探針，來檢測染色體上是否存在相應(yīng)序列，或者細(xì)胞中是否存在特異的RNA分子。在染色質(zhì)相互作用的研究中，如果同時利用兩個或幾個不同熒光標(biāo)記的探針，就可以對染色質(zhì)上兩個或以上特異位點在細(xì)胞核內(nèi)的分布進(jìn)行定位，從而探討不同位點的接近程度，獲知有關(guān)染色體構(gòu)象的信息。這一技術(shù)可以對待測位點的分布進(jìn)行直觀的顯微觀察，研究單個細(xì)胞中相關(guān)位點的空間位置關(guān)系[3-5]。

最近介紹的一個方法ChrISP(chromatin in situ proximity)，是結(jié)合了FISH和原位鄰位連接分析。這種臨位連接分析，最初被用于檢測兩個蛋白質(zhì)是否位于同一個復(fù)合體中(蛋白質(zhì)相互作用)[6]。Chen et al[7]修飾了該方法，細(xì)胞先經(jīng)甲醛固定，再與以地高辛或生物素標(biāo)記的探針雜交，然后利用不同的一抗和二抗檢測，其中二抗交聯(lián)有不同的寡核苷酸序列。添加的長接頭和熒光標(biāo)記的短接頭寡核苷酸，當(dāng)兩個位點間距離小于16.2 nm時，可形成一個熒光標(biāo)記的環(huán)狀DNA分子，從而得到陽性信號。類似的，電鏡技術(shù)也可以用于觀察單個細(xì)胞中兩個已知位點的相互作用[8], 雖然分辨率很高，但是由于實驗程序比較繁瑣，所以較少應(yīng)用。

由于受限于已知位點，單次實驗中較少可用的探針，以及分辨率較低，尤其是僅限于研究已知位點的不足，F(xiàn)ISH及相關(guān)技術(shù)一般難于用于檢測未知位點的相互作用以及大規(guī)模的基因組水平的研究。但是FISH及其相關(guān)技術(shù)可為3C數(shù)據(jù)提供直觀的佐證。

表1研究染色質(zhì)相互作用的主要技術(shù)

技術(shù)簡稱原名檢測位點檢測手段主要文獻(xiàn)FISH(熒光原位雜交)Fluorescence in situ hybridiza-tion兩個或少數(shù)幾個位點間熒光顯微鏡/共聚焦顯微鏡[3,5,7]3CChromosome conformation cap-ture兩個或少數(shù)幾個位點間PCR,瓊脂糖電泳;定量PCR[9,10]4C“circular3C”or “chromosome conformation capture-onchip”特定位點與所有其他位點基因芯片[11,12]5CChromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C)多個位點與多個位點基因芯片或下代測序技術(shù)[13]Hi-Ca high-throughput extension of 3C所有位點之間下代測序技術(shù)[14]ChIP-3C (ChIP-loop)Chromatin immunoprecipitati-on-3C/loop兩個或少數(shù)幾個位點間PCR,瓊脂糖電泳;定量PCR[15,16]ChIA-PETChromatin Interaction Analy-sis by paired-end Tag se-quencing一個蛋白質(zhì)介導(dǎo)的所有位點之間下代測序技術(shù)[5,17,18]

2 3C及其衍生技術(shù)

染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)(3C)最初是從研究酵母染色體構(gòu)象中建立起來的[8]，后來在高等哺乳動物細(xì)胞株中得到應(yīng)用和發(fā)展，如用于研究人基因組的一些基因座 beta球蛋白，IGF2 印記位點等[19-20]。這一系列技術(shù)的發(fā)展，是基于一個并不復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)，將物理距離靠近的DNA分子在原位進(jìn)行限制性酶切和臨位連接，再檢測是否有異常DNA分子(線性距離較遠(yuǎn)或位于不同染色體上)形成。具體過程如下：對一個細(xì)胞群體進(jìn)行甲醛固定，細(xì)胞經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化或細(xì)胞懸浮液經(jīng)超聲波處理，得到平均長度為2～3個核小體長度的染色質(zhì)絲。由于轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子、RNA轉(zhuǎn)錄復(fù)合體等蛋白質(zhì)之間以及與DNA特定序列之間存在著相互作用，因而形成蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體。而這種相互作用的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體在適當(dāng)條件下會在原位被固定下來。再對染色質(zhì)片段進(jìn)行連接，從而獲得一個含有各種連接產(chǎn)物DNA片段的文庫(3C文庫)，然后對重新形成的DNA片段進(jìn)行鑒定、基因組比對和定量分析，獲得染色質(zhì)不同位點相互接近的頻率，從而推斷染色質(zhì)的空間位置信息，繪制染色質(zhì)相互作用圖譜。

3C技術(shù)結(jié)合其他技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展出了4C、5C、CHIP-3C/Loop、ChIA-PET和Hi-C等技術(shù)(見表1)，這些技術(shù)各有特點，后期所用的實驗手段或處理程序不同，能夠鑒定到的相互作用也不同。

常規(guī)3C技術(shù)可以用來檢測兩個或或少數(shù)幾個位點間的相互作用(見表1)。細(xì)胞經(jīng)固定，限制性內(nèi)切酶或超聲波處理，DNA片段經(jīng)鄰位連接(構(gòu)象“捕獲”)，經(jīng)去交聯(lián)和DNA純化，得到包含DNA片段兩端自體連接或不同DNA片段異體連接的3C文庫。3C文庫DNA的檢測主要通過設(shè)計位點特異的PCR引物，經(jīng)PCR擴增后用瓊脂糖凝膠電泳來檢測，或者輔之以Sanger測序來確定，也可以用實時PCR來定量[9-10]。當(dāng)DNA上線性距離較遠(yuǎn)的兩個DNA片段，由于染色體空間構(gòu)象變化而相互靠近，并被鄰位連接而擴增得到陽性信號。這一方法結(jié)合FISH技術(shù)，可以為目標(biāo)位點間的位置關(guān)系提供染色質(zhì)相互作用的確切證據(jù)。其不足之處如上所述，由于依賴于特異性擴增(根據(jù)已知DNA序列設(shè)計引物進(jìn)而對新形成的融合DNA片段擴增)，所以只能研究少數(shù)已知位點間的染色質(zhì)相互作用。

4C技術(shù)與常規(guī)3C基本相同，但部分克服了3C檢測少數(shù)已知位點的不足。4C技術(shù)的一般策略是，細(xì)胞經(jīng)固定后，首先利用限制性內(nèi)切酶(識別4堿基或6堿基的內(nèi)切酶)酶切，再用DNA連接酶進(jìn)行鄰位連接，用于檢測特定的一個已知位點(誘餌位點)與其他位置位點間的相互作用。由于在4C文庫的構(gòu)建過程中會有一些環(huán)狀DNA形成(與3C類似)，因而可以利用已知位點設(shè)計引物，通過反向PCR擴增得到與該誘餌位點相互作用的其他染色質(zhì)位點信息。4C文庫可以通過下代測序技術(shù)或基因芯片技術(shù)來檢測[21]。4C技術(shù)可以比常規(guī)3C技術(shù)得到更多的染色質(zhì)相互作用信息，適合于對某一基因座的未知調(diào)控元件進(jìn)行鑒定或?qū)υ撊旧|(zhì)位點所參與的空間構(gòu)象進(jìn)行探討(見表1)。

5C技術(shù)因為類似于復(fù)制了部分3C文庫(3C-Carbon Copy),因而稱為5C，是基于3C和連接介導(dǎo)的擴增(ligation-mediated amplification,LMA)技術(shù)。5C技術(shù)是在構(gòu)建3C文庫的基礎(chǔ)上，通過精心設(shè)計兩套引物序列，利用Tag連接酶連接兩個與文庫中DNA精確雜交的引物序列，再通過通用引物序列的擴增，獲得3C文庫中部分相互作用的染色質(zhì)位點信息，詳細(xì)步驟請見[13]。5C曾用于研究beta球蛋白基因座與調(diào)控序列間的染色質(zhì)相互作用，由于需要設(shè)計兩套引物，并受限于研究特定的DNA區(qū)域，所以應(yīng)用比較有限。

如果說3C、4C和5C 技術(shù)都是探討已知位點與已知或未知的位點的相互作用，從而探討染色體的局部構(gòu)象，那么在此基礎(chǔ)上建立的Hi-C技術(shù)則可以用來檢測基因組水平的部分或所有未知位點之間的相互作用。Hi-C方法也是在3C技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的。細(xì)胞經(jīng)固定和限制性內(nèi)切酶酶切，形成的5’突出末端用dNTP(包含生物素化的dCTP)填充，在稀釋的情況下將平頭末端再連接。產(chǎn)物經(jīng)超聲波處理，含生物素的DNA片段經(jīng)親和素沉淀(見圖1)。制得的Hi-C文庫，再經(jīng)雙端高通量測序，分析和基因組序列比對，檢測全基因組染色質(zhì)間的相互作用位點[14]。Hi-C方法是在基因組水平研究所有染色質(zhì)位點間可能存在的染色質(zhì)相互作用關(guān)系的技術(shù)。獲得的信息非常豐富，一般信號噪音比較高。經(jīng)過處理后的信息，可以和5C數(shù)據(jù)一樣以二維熱點圖(heat map)的方式來呈現(xiàn)[14]。

細(xì)胞經(jīng)固定，限制性內(nèi)切酶酶切，末端用dNTP(包含生物素化的dCTP)填充，連接，超聲波處理，親和素沉淀，雙端高通量測序，分析和基因組序列比對。紅線和藍(lán)線表示DNA分子，各種顏色的橢圓表示與DNA結(jié)合的各種蛋白質(zhì)，如深綠色橢圓表示雌激素受體，較大的黃色橢圓表示RNA聚合酶II，黑色線段表示接頭或限制性酶切位點(連接后)，其上的綠色小圓表示生物素分子。圖示兩個發(fā)生高頻率染色質(zhì)相互作用的區(qū)域。圖1 Hi-C的主要流程

ChIP-3C或ChIP-loop技術(shù)則是結(jié)合了ChIP和3C技術(shù)，可以研究某一蛋白質(zhì)介導(dǎo)的染色質(zhì)之間相互作用，如雌激素受體或RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的增強子-啟動子間的相互作用[5,16]。ChIP-3C一般是在利用某一特異性抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀的過程中，對免疫復(fù)合物中的DNA片段進(jìn)行鄰位連接，再經(jīng)去交聯(lián)和DNA純化，可以得到特定蛋白質(zhì)介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用的3C文庫。其檢測方法與前述3C文庫的相同。不足之處是對于每一個染色質(zhì)間的相互作用，都需要設(shè)計相應(yīng)的引物來擴增并分析。

同Hi-C技術(shù)一樣，ChIA-PET技術(shù)也是在基因組水平檢測全新的染色質(zhì)相互作用的技術(shù)。ChIA-PET是我們首先用雌激素受體陽性的人乳腺癌細(xì)胞MCF7建立起來的，后來在小鼠、干細(xì)胞等材料中也得到了應(yīng)用[5,17]。利用不同的ChIP 級的特異性抗體，針對雌激素受體和RNA聚合酶II等，可以探測到以該被檢測蛋白為錨定點介導(dǎo)的基因組水平染色質(zhì)相互作用。ChIA-PET技術(shù)與ChIP-3C技術(shù)在前期的樣品制備過程基本相同，如細(xì)胞經(jīng)固定、超聲波處理和染色質(zhì)免疫沉淀。此后，ChIP產(chǎn)物在稀釋后(目的是為了降低非特異性臨位連接產(chǎn)物)，連接生物素化的接頭(含MmeI位點)，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體經(jīng)65℃去交聯(lián)，DNA經(jīng)純化，MmeI消化，親和素交聯(lián)的磁珠沉淀。制得的ChIA-PET文庫，經(jīng)高通量測序，分析和基因組序列比對，就可以繪制如雌激素受體介導(dǎo)的全基因組染色質(zhì)纖維相互作用的位點(見圖2)。ChIA-PET通過鑒定增強子-啟動子間相互作用而形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以同時鑒定某一時刻所有與目標(biāo)基因位置靠近的增強子或其他DNA調(diào)控元件[5,17]。

細(xì)胞經(jīng)固定，超聲波處理，抗體免疫沉淀，用生物素化的ChIA-PET接頭(含MmeI位點)連接。再經(jīng)MMeI酶切，用鏈霉親合素交聯(lián)的珠子純化重新連接的DNA分子。然后加上雙末端測序接頭，擴增，測序，基因組比對，鑒定蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點及染色質(zhì)長程相互作用。紅線和藍(lán)線表示DNA分子，各種顏色的橢圓表示與DNA結(jié)合的各種蛋白質(zhì)，如深綠色橢圓表示雌激素受體，較大的黃色橢圓表示RNA聚合酶II，黑色線段表示接頭，其上的綠色小圓表示生物素分子。圖示檢測到的兩個染色質(zhì)位點間的相互作用。圖2 ChIA-PET的主要流程

ChIA-PET與Hi-C的主要不同點有：一是Hi-C沒有ChIP這一步，因而不受限于ChIP級別的特異性抗體；二是兩者在初次連接DNA片段時所用的接頭不同，因而制備文庫的策略不同；三是ChIA-PET只能檢測到細(xì)胞群體中以與DNA結(jié)合的某一蛋白質(zhì)所介導(dǎo)的所有的染色質(zhì)位點間的相互作用，而Hi-C理論上可以捕捉到一定的細(xì)胞群體中所有的染色質(zhì)位點間的相互作用，包括轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的以及染色質(zhì)與染色質(zhì)間直接的相互作用。對于染色質(zhì)上不同位點間的相互作用頻率而言，由于同一染色質(zhì)上的順式相互作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不同染色質(zhì)上的反式相互作用(cis-trans ratio ，CTR)，以及作用強度隨距離而衰減(distance-dependent decay, DDD)，這就使得Hi-C技術(shù)的分辨率目前只能達(dá)到0.1到1 Mb[14]或者5-10kb[22]。而ChIA-PET通過染色質(zhì)免疫沉淀一步消除了大量非特異性的相互作用信號，所以理論上的分辨率應(yīng)該為實驗中能區(qū)分的DNA上臨近的兩個蛋白質(zhì)結(jié)合位點。3C技術(shù)結(jié)合目前的高通量下代測序技術(shù)，已經(jīng)逐漸成為研究染色質(zhì)間相互作用的主流方向。因為ChIA-PET和Hi-C技術(shù)是目前在基因組水平探討和鑒定染色質(zhì)長程相互作用的最主要技術(shù)，因此我們重點回顧利用這兩個技術(shù)獲得的主要進(jìn)展。

3 染色體構(gòu)象與基因表達(dá)及染色體三維構(gòu)象

3.1 雌激素受體介導(dǎo)的染色質(zhì)間相互作用 雌激素受體(EstrogenReceptors,ERs)是核受體家族的一員，ERs在發(fā)育、正常生理、病理過程中起著重要作用，因此研究ERs介導(dǎo)的基因調(diào)控機理對于深入研究相關(guān)疾病具有重要意義。最初不同研究組利用不同的方法對雌激素受體α(ERα)在基因組中的結(jié)合位點進(jìn)行定位時，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)結(jié)合位點都分布在遠(yuǎn)離基因啟動子的5kb以上的地方[23-24],因此如何界定這些潛在的調(diào)控元件所控制的特定基因，成為研究雌激素信號通路的一個挑戰(zhàn)。以TFF基因為例，我們證實在其上游10.5kb的一個ERα結(jié)合位點在促進(jìn)TFF1基因的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用，通過形成增強子-啟動子環(huán)狀結(jié)構(gòu)相互作用，從而促進(jìn)其高表達(dá)[16,25]。常規(guī)的這類研究DNA調(diào)控序列的方法，每次只能針對少量位點，比較費時費力。為了探討這些基因組范圍內(nèi)ERα結(jié)合位點所調(diào)控的基因，CHIA-PET技術(shù)應(yīng)運而生[5]。利用MCF7 細(xì)胞，在初次實驗中從兩個文庫中各鑒定到1475個和3561個相互作用，前100個相互作用中有80% 是相同的。總共鑒定了至少689 ERα 結(jié)合的染色質(zhì)相互作用區(qū)域(兩次實驗?zāi)苤貜?fù)得到的數(shù)據(jù)。這一方面表明染色質(zhì)相互作用的動態(tài)性，一方面表示那些強的相互作用相對而言比較容易被捕捉到。隨著進(jìn)行更深度的測序，已檢測到更多的相互作用(未發(fā)表數(shù)據(jù))。對于鑒定與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的未知的DNA調(diào)控元件來說，CHIA-PET技術(shù)目前而言仍是最為高效的方法。ERα介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用與基因表達(dá)有著密切的關(guān)系。在錨定點附近的基因，多數(shù)呈活躍表達(dá)狀態(tài)，而環(huán)內(nèi)基因則呈現(xiàn)被抑制趨勢。所以這種染色質(zhì)相互作用，可以促進(jìn)一些基因的表達(dá)，同時也抑制另外一些基因的活性[5,26]。

另一發(fā)現(xiàn)是，ERα與特異的雌激素反應(yīng)元件的結(jié)合及其介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用，需要FoxA1和AP2γ的參與[27-28]。61%的雌激素受體結(jié)合位點有FoXA1和AP2γ[28]。在這種雌激素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)過程中，AP2γ可能和FoxA1一樣，起著前驅(qū)因子的作用。所以目前我們認(rèn)為ER介導(dǎo)的染色質(zhì)長程相互作用的機理，可能如圖3所示[28]。

沒有雌激素(E2)時，ERα調(diào)控的基因不表達(dá)或低表達(dá)。當(dāng)有E2存在時，E2進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與ERα結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與FoxA1(F)和AP2γ(A)等作用結(jié)合在雌激素反應(yīng)元件上，并與其他轉(zhuǎn)錄因子作用，與啟動子發(fā)生染色質(zhì)相互作用，激活RNA聚合酶II(RNAP II)的轉(zhuǎn)錄活性，從而促使目標(biāo)基因表達(dá)。P,p300/CBP;T,TFIID;M,Mediator。 圖3 雌激素受體ERα介導(dǎo)的染色質(zhì)長程相互作用模型

3.2 RNA聚合酶II介導(dǎo)的染色質(zhì)間相互作用 RNA聚合酶II對mRNA,snRNA和許多microRNA的轉(zhuǎn)錄起著關(guān)鍵作用。各種轉(zhuǎn)錄因子如ERα等介導(dǎo)的染色質(zhì)長程相互作用，很多都和啟動子區(qū)的RNA聚合酶II有關(guān)，所以基因組水平的RNA聚合酶II介導(dǎo)的染色質(zhì)長程相互作用也是很重要的一方面，這種相互作用最初在MCF7中得到了確認(rèn)。起初鑒定到了RNA 聚合酶II介導(dǎo)的12,626相互作用，隨著深度測序，得到了成倍的——24,126個相互作用[18]。Li 等探討了包括MCF7等5種細(xì)胞株中RNA 聚合酶II相關(guān)的啟動子可以作為染色質(zhì)相互作用的關(guān)鍵錨點。而啟動子-啟動子相互作用對于多數(shù)臨近基因的表達(dá)有促進(jìn)作用[18]。這表明傳統(tǒng)意義上的啟動子在染色質(zhì)相互作用的環(huán)境下可以在某種程度上扮演增強子的作用。

類似的發(fā)現(xiàn)也存在于3種小鼠細(xì)胞類型中，并且與干細(xì)胞的分化過程有關(guān)。Zhang 等[29]比較了處于不同分化程度的3種小鼠細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells ，ESCs), 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)和神經(jīng)祖細(xì)胞(neurosphere stem/progenitorcells，NPCs)中RNA聚合酶II介導(dǎo)的相互作用，總共檢測到40 000 個染色質(zhì)長程相互作用。當(dāng)啟動子定義為距離轉(zhuǎn)錄起始位點+/- 2.5堿基對時，一半的染色質(zhì)相互作用表現(xiàn)為啟動子-啟動子之間，另外的表現(xiàn)為啟動子-基因內(nèi)增強子或啟動子-基因間增強子。這種相互作用表現(xiàn)出很強的細(xì)胞特異性。并在3種細(xì)胞株中分別鑒定了8,309, 4,463 和3,649個潛在的遠(yuǎn)距離DNA調(diào)控元件。

Kieffer-Kwon等也有類似的發(fā)現(xiàn)，小鼠多能胚胎干細(xì)胞和已分化的B淋巴細(xì)胞基因組中有不同的增強子和啟動子之間相互作用的圖譜，而且也發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞和已分化的B淋巴細(xì)胞中，活躍表達(dá)的基因，例如Myc和Pim1等，在兩種細(xì)胞中使用著不同的增強子組。這也表明增強子和啟動子的相互作用，增加了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性并表現(xiàn)出細(xì)胞發(fā)育階段的特異性[30]。但是對于外源激素刺激的信號傳導(dǎo)過程研究，表明這種增強子-啟動子之間的染色質(zhì)位點間的相互作用，在外源激素刺激前，就已經(jīng)存在。Jin等用Hi-C研究了TNF-α 信號通路中，NF-κB介導(dǎo)的啟動子-增強子的相互作用。他們發(fā)現(xiàn)這種相互作用的成環(huán)結(jié)構(gòu)，在TNF-α 信號傳遞前就已存在。而且這種相互作用也在IFN-γ, TNF-α, β-estradiol和5α-dihydrotestosterone處理的不同細(xì)胞中預(yù)先存在[22]。這與我們早期在雌激素(β-estradiol)介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用中的研究并不完全一致。造成這種差異的原因以及這種預(yù)先成環(huán)結(jié)構(gòu)的存在是否具有普遍意義，值得進(jìn)一步探討。

3.3 CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)間相互作用 早期的研究發(fā)現(xiàn)，CTCF(CCCTC-binding factor，CTCF)是特異性地與DNA上的CCCTC序列結(jié)合的蛋白，因為可以阻斷增強子對基因的作用，具有絕緣子或隔離子特性，所以又稱為轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白(Transcriptional repressor CTCF)。CTCF在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的組織中起著十分關(guān)鍵的作用[31-32]。Handoko等用ChIA-PET技術(shù)，研究了CTCF在小鼠胚胎多能干細(xì)胞中的結(jié)合位點和介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用[31]。結(jié)果表明CTCF在建立和維持染色質(zhì)的局部構(gòu)象，調(diào)節(jié)基因簇的協(xié)同表達(dá)，介導(dǎo)DNA調(diào)控元件與啟動子的相互作用，以及染色體局部的構(gòu)象等方面發(fā)揮著重要作用。他們綜合所有CTCF的ChIA-PET文庫，得到了1480個順式和336個反式染色質(zhì)相互作用。一部分CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用錨定點與p300的結(jié)合位點一致，而p300是轉(zhuǎn)錄激活因子。降低CTCF蛋白質(zhì)水平及其介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用，相應(yīng)降低了該區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄水平，從而揭示在一些情況下CTCF可以阻斷增強子的活性，而有時也可以通過介導(dǎo)這種相互作用，使p300等轉(zhuǎn)錄因子與特定基因的啟動子發(fā)生長程相互作用，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄活性。DNA的核纖層結(jié)合域(Lamin-associated domains，LADs)兩側(cè)，常見CTCF環(huán)狀結(jié)構(gòu)。CTCF通過扮演隔離子的角色，限定LADs局部區(qū)域，使LAD區(qū)域內(nèi)的基因呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。同時，CTCF的分布與組蛋白的修飾也密切相關(guān)，如H3K4me1和H3K27me3的分布與 CTCF的結(jié)合位點高度相關(guān)，H3K36me3 呈高度負(fù)相關(guān)[33-34]。類似的結(jié)果也在SMC1A，一個Cohesin復(fù)合體的亞基參與的小鼠研究中被證實[35]。Cohesin與CTCF常相互作用，是功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)。Cohesin介導(dǎo)的相互作用影響細(xì)胞干性基因表達(dá)，與維持細(xì)胞的多能性密切相關(guān)[36-37]。因而Cohesin/CTCF介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用是在不同組織中基因特異表達(dá)的一種基本調(diào)控機制。

Zuin et al[38]2013 探討了CTCF和Cohesin復(fù)合體在染色體高級組織結(jié)構(gòu)中的作用，證實與CTCF 和Cohesin對于染色體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有不同的作用。Cohesin更多參與距離較短的染色質(zhì)位點間的相互作用，而CTCF既參與距離較短的染色質(zhì)位點間的相互作用，也參與臨近拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域之間的相互作用。分別降低兩者的蛋白質(zhì)水平會引起不同的染色體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化，也相應(yīng)引起了不同的基因表達(dá)譜的變化。

如果比較CTCF和ERα介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用，我們會發(fā)現(xiàn)二者介導(dǎo)的染色質(zhì)相互作用對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并非單一方向的，而是具有雙向調(diào)節(jié)作用。既可以抑制被調(diào)控的基因，也可以促進(jìn)一些基因的活性。另外ERα介導(dǎo)的染色質(zhì)長程相互作用形成的環(huán)內(nèi)基因有一定程度的抑制，也說明雌激素受體除了作為積極參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控以外，還可以通過介導(dǎo)染色質(zhì)的相互作用而表現(xiàn)出和CTCF相同的功能，即對染色體進(jìn)行區(qū)域化分隔，從而在染色體高級結(jié)構(gòu)層次對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

3.4 染色質(zhì)相互作用與染色質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)的空間組織 關(guān)于染色質(zhì)絲在細(xì)胞核內(nèi)的組織，有多種模型被提出，如有分形小球(fractal globule)，平衡小球(equilibrium globule)等模型,其中染色質(zhì)絲的分形小球模型獲得了一些實驗數(shù)據(jù)的支持[39]。分形小球模型主要指多聚體在凝聚而形成的一種致密的狀態(tài)，由于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的限制,不會在鏈內(nèi)部形成“結(jié)狀”結(jié)構(gòu)。Dekker研究組根據(jù)以上這些相互作用的頻率及其位點間的距離判斷，在百兆堿基對的尺度上，染色質(zhì)線在細(xì)胞核中的分布更符合分形球狀模型,而不是以前認(rèn)為的平衡球狀模型[14]。

關(guān)于染色體在細(xì)胞核內(nèi)的組織以及對于染色體不同結(jié)構(gòu)域的定義仍沒有統(tǒng)一。但一般認(rèn)為，每條染色體在細(xì)胞核內(nèi)占據(jù)著一定的區(qū)域，而每條染色體由于不同的結(jié)構(gòu)域組成。染色體不是隨機雜亂分布的，而是遵循著一定的規(guī)律[40-43]。如Cremer 等認(rèn)為，在間期細(xì)胞核中，染色體領(lǐng)域(chromosome territories, CTs)是一個細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的一個基本的特征[40]。對少量的染色體部分的研究表明，尺度大約為1Mb的染色體片段是組成染色體域的基本單位[40,44]。他們認(rèn)為染色體領(lǐng)域在光鏡下表現(xiàn)為吉姆薩染色后的深染染色質(zhì)團塊。而這些1Mb的染色質(zhì)域又是由小的環(huán)狀染色質(zhì)域組成的[40]。

而最近Dekker和Lander 等合作用lymphoblastoid和K562細(xì)胞得到了染色體長程相互作用資料[42]。他們認(rèn)為每條染色體在細(xì)胞核內(nèi)占據(jù)著一定的區(qū)域(Chromosome Territories，CTs),即每條染色體占據(jù)著的核內(nèi)區(qū)域為其染色體領(lǐng)域(圖4 扇形部分)。同時，每條染色體從空間分布上可以大致分為兩種次級結(jié)構(gòu)域——區(qū)隔(compartment A or B)。其中一種區(qū)隔基因密度較高，染色體多呈開放狀態(tài)(見圖4中A區(qū)隔)；而另一類基因密度較低，染色體構(gòu)象較致密(見圖4中B區(qū)隔)。有數(shù)據(jù)表明大約5Mb的區(qū)隔A和B沿著染色質(zhì)絲分布，區(qū)隔間可以發(fā)生染色質(zhì)的相互作用，一般A傾向于與A作用，B傾向于與B作用，雖然來自不同區(qū)隔中的位點相互作用頻率較低。而區(qū)隔是由若干個染色體拓?fù)渎?lián)合域(topologically associating domains ，TADs)組成。每個區(qū)隔內(nèi)的一系列染色質(zhì)位點可以發(fā)生頻率較高的相互作用(見圖4)。

圖示間期細(xì)胞核中一條染色體的局部放大。扇形區(qū)域表示一個放大的染色體領(lǐng)域(CT)。圓A和B表示染色體的兩個相鄰區(qū)隔(CC)，其中A表示比較活躍的基因比較多的區(qū)域，而B表示不太活躍基因密度較低的部分，分別大概5Mb左右。A和B分別有數(shù)個拓?fù)渎?lián)合域(TADs)組成，每個拓?fù)渎?lián)合域約500kb。其中的部分拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域用紅色或藍(lán)色圈表示(CTCF在全基因組都有分布，但在拓?fù)渎?lián)合域之間有較多分布，圖中未標(biāo)示)。圖4 間期細(xì)胞核中染色質(zhì)的局部構(gòu)象

21號染色體大小為48Mb，如果假設(shè)每個拓?fù)渎?lián)合域為500kb,每10個拓?fù)渎?lián)合域組成一個區(qū)隔，則最小的21號染色體就由近10個區(qū)隔組成。而最大的1號染色體(249Mb)由大約50個區(qū)隔組成。當(dāng)然實際情形要比這復(fù)雜得多，不僅因為這些拓?fù)渎?lián)合域和區(qū)隔等次級域的大小不是均勻的，而且因為染色體也是動態(tài)的。

4 3C及其衍生技術(shù)的應(yīng)用前景

3C技術(shù)自從建立以來，已經(jīng)發(fā)展得比較成熟了，尤其以ChIA-PET和Hi-C技術(shù)為代表，但也有一些不足之處。由于這些結(jié)果都是來自于許多細(xì)胞組成的樣品，即基于對細(xì)胞群體的實驗和統(tǒng)計分析，因而難于估計不同細(xì)胞中的即時的染色質(zhì)相互作用和染色質(zhì)組織特點。如何解析單個細(xì)胞中的染色質(zhì)相互作用和染色體的空間組織，以及在發(fā)育過程中，或者疾病發(fā)生發(fā)展過程中染色質(zhì)相互作用和基因組結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，仍是研究的難點。另外，3C技術(shù)由于臨近染色體的隨機靠近，捕獲的信號會湮沒那些特征性的比較穩(wěn)定的染色質(zhì)位點間的聯(lián)系。尤其是如何降低Hi-C技術(shù)的噪音，提高靈敏度也是需要關(guān)注的。不過，盡管有一些不足，3C技術(shù)仍然是很有用的基因組學(xué)研究工具。

首先，可以通過特定的轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白質(zhì)的免疫沉淀，用于鑒定未知的與基因調(diào)控表達(dá)有關(guān)的重要序列，是否與基因啟動子區(qū)存在著相互作用。當(dāng)然，利用3C技術(shù)獲得的染色質(zhì)相互作用，對于他們是否具有增強子的作用或其他功能，還需要通過其他實驗，如熒光素酶報告基因?qū)嶒?，轉(zhuǎn)基因斑馬魚、TALENs或CRISPR/Cas等基因組編輯工具來檢驗。

其次，全基因組水平的染色質(zhì)特異以及非特異的相互作用數(shù)據(jù)，將會為進(jìn)一步解析染色質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)提供豐富的資料。如腫瘤的發(fā)生發(fā)展一般是一個長期復(fù)雜的過程，不僅與若干個基因突變有關(guān)，在某些腫瘤中，還常伴隨著染色體結(jié)構(gòu)的改變，如染色體倍性的改變，染色體片段的增加，缺失及易位，基因的擴增等。這些染色體一級結(jié)構(gòu)的改變，是否以及如何影響到染色體高級構(gòu)象的變化，是一個值得探討的問題。如在ICF綜合癥(Immunodeficiency-centromeric instability-facial anomalies syndrome)中, DNA甲基化的改變影響到了染色體領(lǐng)域的變化。類似的， 3C技術(shù)無疑也可以用于研究在一些病理變化過程中,染色體的三維構(gòu)象是否呈現(xiàn)特異性的的變化，是否可以成為相關(guān)疾病的特征性標(biāo)志。

另外，3C數(shù)據(jù)不僅可以用于研究染色體的高級結(jié)構(gòu)，也可以用于研究基因組的線性序列。如最近Kaplan等[45]利用染色質(zhì)相互作用強度表現(xiàn)為“順式”和“近距離較強”的特性，利用Hi-C技術(shù)預(yù)測和拼接一些尚未連接的人類基因組或其他基因組的缺口區(qū)域。

最后，這些技術(shù)也可以用于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms ，SNPs)的相關(guān)研究。比如可以通過探討有統(tǒng)計學(xué)意義的與疾病相關(guān)的已知SNPs位點，是否參與染色質(zhì)位點之間的相互作用，進(jìn)而參與基因的調(diào)控，從而鑒別基因本體以外的與疾病相關(guān)的SNPs并探討其可能的功能。

總之，隨著未來建立在3C基礎(chǔ)之上的實驗技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展和應(yīng)用，以及相應(yīng)計算技術(shù)的開發(fā)，我們無疑會得到豐富的染色質(zhì)相互作用的資料，這些資料必將極大促進(jìn)功能基因組的研究。

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