劉甦蘇，左 琴，周舒雅，王辰飛，賀爭鳴，李保文，范昌發(fā)

(中國食品藥品檢定研究院，國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物種子中心，北京 100050)

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因工程小鼠越來越多的應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，已滲透到醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、動物育種學(xué)等各個領(lǐng)域。模式小鼠模型在繁殖建系過程中，需要不斷對其子代進(jìn)行基因型鑒定，因而建立快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的基因型鑒定方法很有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[1-2]。southern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[3]是模式動物基因型鑒定常用的方法，而后者因操作簡單快速，應(yīng)用更為廣泛[4]。引物設(shè)計(jì)是PCR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之一，其中反應(yīng)產(chǎn)物長度直接影響擴(kuò)增效率。以總DNA為模板的普通PCR反應(yīng)，引物設(shè)計(jì)時(shí)產(chǎn)物長度在100～600 bp為宜[5-6]。在批量模式小鼠的基因型鑒定中，總DNA的提取工作量較大，耗時(shí)耗力，而PCR 模板的DNA得率和純度直接影響基因型鑒定的準(zhǔn)確性和效率，因而有必要對其進(jìn)行探索。本文以常規(guī)PCR片段長度為例，采用苯酚抽提法[7]、異丙醇沉淀法[8]、鼠耳煮沸法提取模式小鼠基因組DNA，測定其OD260與OD280的吸光值, 評估核酸的純度和得率，并通過PCR方法進(jìn)行模式小鼠基因型鑒定，旨在確立更加實(shí)用的基因型鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

模式小鼠選取本單位自主建立C57-ras模型小鼠【SCXK(京)2009-0017】，飼養(yǎng)于國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物種子中心【SYXK(京)2011-0005】，繁育環(huán)境為SPF級，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在清潔級環(huán)境中進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)在中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑

鼠尾裂解緩沖液儲存濃度(0.2 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 5 mmol/L EDTA (pH 8.0), 0.2 % SDS, 10 mg/mL蛋白酶K)，鼠耳裂解10倍母液[100 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA (pH 8.0)]，常用緩沖液TE buffer、TAE buffer 按照《分子克隆》手冊配置；Tris平衡酚購自于天津?yàn)笊镏破饭荆琑Nase A和蛋白酶K購自于大連寶生物，其它常見生化試劑乙醇、異戊醇、異丙醇、氯仿購自北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司。1.5離心管和PCR管及蓋購自于AXYGEN。檢測儀器為美國ABI PCR儀，Thermo nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)。引物由諾賽基因公司合成。

1.3 基因組DNA提取的方法

選取C57-ras模型小鼠10只，分別留取相應(yīng)組織分別用以下三種提取基因組DNA

1.3.1 方法一苯酚抽提法：

(1) 剪取約1 cm鼠尾置于1.5 mL的離心管中

(2) 每管加入配制好的250 μL裂解液和5 μL蛋白酶K，55℃水浴過夜

(3) 每管加入250 μL Tris平衡酚。室溫離心2 min取上清至另一個新的EP管中

(4) 加入等體積氯仿：異戊醇(49:1)充分混勻后，室溫離心2 min取上清至新的EP管中

(5) 加入25 μL醋酸銨和500 μL異丙醇, 試管上下顛倒混勻，室溫離心10 min，棄上清

(6) 冷藏的75%乙醇輕混后漂洗一次，離心棄上清風(fēng)干，加入TE和RNase A，55℃水浴溶解2 h

1.3.2 方法二異丙醇沉淀法：

(1) 剪取約1 cm鼠尾置于1.5 mL的離心管中。

(2) 每管加入配制好的500 μL裂解液(含蛋白酶K 5 μL，稀釋終濃度：100 μg/mL)，55℃水浴過夜

(3) 取出室溫放置10～15 min，室溫離心15 min后，吸取上清至另一個新的EP管中

(4) 加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫放置10 min，離心后棄上清

(5) 冷藏的75%乙醇輕混后漂洗一次，離心后棄上清液風(fēng)干，加入TE和RNase A，55℃水浴溶解2 h

1.3.3 方法三鼠耳煮沸法：

(1) 先配制2種10制母液100 mmol/L NaOH和1 mmol/L EDTA (pH 8.0)，分別于試劑瓶中常溫保存。兩種母液混合并分別稀釋10倍，配制成使用液(現(xiàn)用現(xiàn)配)

(2) 剪取約1 cm鼠尾置于1.5 mL的離心管中

(3) 每個樣品加入現(xiàn)配的裂解液，95℃加熱10 min，降至室溫后直接吸取上清作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)

1.4 總DNA瓊脂糖凝膠電泳及質(zhì)量檢測

分別采用紫外分光光度計(jì)法、瓊脂糖凝膠電泳法, 檢測所得DNA 的得率和質(zhì)量。DNA經(jīng)TE稀釋后分別取1.5 μL，用紫外分光光度計(jì)測定260和280 nm的光吸收值, 計(jì)算DNA 得率及純度。電泳檢測取2 μL總DNA與6×loading buffer 按比例混勻。用1% 的瓊脂糖凝膠( 含0.5 μg/ mL EB) 電泳檢測。

1.5 PCR反應(yīng)擴(kuò)增檢測

分別以三種方法提取的總DNA，通過PCR反應(yīng)進(jìn)行基因型鑒定。引物設(shè)計(jì)針對轉(zhuǎn)基因的編碼序列，上游引物為Pri. PFT，下游引物為Pri. PRN1735(表1)，目的片段408 bp。PCR 條件為：95℃ 5 min變性；95℃ 30 s；62℃30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)。產(chǎn)物取5 μL用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR反應(yīng)引物序列及退火溫度

表2 三種不同基因組DNA 提取方法結(jié)果比較

2 結(jié)果

2.1 總DNA得率和純度

選取10只C57-ras陽性鼠分別用三種方法提取總DNA，計(jì)算得率和純度，結(jié)果表示方式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。總DNA 得率方面，苯酚抽提法最高，其最高值能達(dá)到48.92 μg, 平均得率為35.32 μg，而異丙醇沉淀法得率最低，平均得率僅為10.38 μg，鼠耳煮沸法介于二者之間平均得率為25.59 μg。在衡量DNA 純度方面，測定光吸收比值是一個重要指標(biāo)[9]，三種提取方法呈現(xiàn)一個遞減的趨勢，結(jié)果與理論值一致。苯酚抽提法和異丙醇沉淀法比值差異不大，平均值分別為1.81和1.7，鼠耳煮沸法所提取的總DNA純度最差，平均比值為1.58(表2)。

2.2 總DNA電泳檢測結(jié)果

取等量總DNA采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。結(jié)果表明，方法一和方法二的總DNA 質(zhì)量較好，每個樣品都有清晰的條帶，方法三提取的效果最差，電泳檢測無清晰的條帶。

2.3 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的條帶結(jié)果

根據(jù)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增ras基因，不同DNA模板本都出現(xiàn)清晰目的條帶(圖2)，表明三種方法提取的DNA均完全可以做為PCR反應(yīng)的模板，達(dá)到篩選轉(zhuǎn)基因陽性鼠的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

2.4 鼠耳煮沸法提取的DNA保存方法比較結(jié)果

鼠耳煮沸法提取的DNA采用常規(guī)-20 ℃保存7 d、30 d后重復(fù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，依然出現(xiàn)清晰目的條帶(圖3)，說明該方法所提取的DNA可以保存一個月左右時(shí)間，在不能及時(shí)開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)依然適用。如果長時(shí)間樣品最好存放于-80℃超低溫冰箱內(nèi)。

注：A苯酚抽提法；B異丙醇沉淀法；C鼠耳煮沸法；Marker：λ-EcoT14。

注：A 苯酚抽提法；B 異丙醇沉淀法；C 鼠耳煮沸法；Marker：D-2000。

注：A圖是鼠耳煮沸法提取的DNA保存0 d的PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果；B圖是鼠耳煮沸法提取的DNA保存7 d的PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果；C圖是鼠耳煮沸法提取的DNA保存30 d的PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果，保存條件均為-20℃保存。Marker為D-2000。

2.5 三種提取方法耗費(fèi)時(shí)間比較

選取10只C57-ras陽性鼠，計(jì)算三種方法提取總DNA的時(shí)間并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。苯酚抽提法和異丙醇沉淀法的提取時(shí)間分別為12.5 h和13 h極顯著(P< 0.01)高于鼠耳煮沸法0.18 h。雖然苯酚抽提法的提取時(shí)間低于異丙醇沉淀法，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)(表3和圖4)。

表3 三種不同提取方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間結(jié)果比較

圖4 三種不同提取方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間比較

3 討論

為了維系國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物種子中心日常工作，常常面臨批量模式小鼠基因型鑒定。建立簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)的總DNA提取方法能有助于提高工作效率。常見提取總DNA 的方法有苯酚抽提法、堿裂解法、鹽沉淀法等。肖波[10]等對苯酚抽提法和鹽沉淀法[11]進(jìn)行過相關(guān)比較。本文比較分析了苯酚抽提法、異丙醇沉淀法和鼠耳煮沸法三種方法。

苯酚抽提法DNA得率最高，異丙醇沉淀法最低；純度則是苯酚抽提最好，鼠耳煮沸法最差。三種方法提取的總DNA均可作為PCR反應(yīng)的模板，達(dá)到基因型鑒定目的。苯酚抽提法和異丙醇沉淀法提取的DNA純度較好，但在批量鑒定時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，基因型工作易出現(xiàn)延誤工作的情況。綜合比較成本，效果后發(fā)現(xiàn)，鼠耳煮沸法有以下優(yōu)點(diǎn)：

3.1 操作步驟簡便，減少交叉污染

苯酚抽提法操作繁瑣且所用試劑品種較多，增加了PCR 污染的可能性。改進(jìn)后的異丙醇沉淀法，減少了酚/氯仿抽提步驟，降低了操作風(fēng)險(xiǎn)和交叉污染的可能性。鼠耳煮沸法操作步驟更為簡單，煮沸后上清可直接進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)一步減少各樣品交叉污染的幾率。

3.2 縮短實(shí)驗(yàn)周期，快速篩選鑒定

苯酚抽提法和異丙醇沉淀均需過夜消化樣本，異丙醇沉淀法雖減少了酚/氯仿抽提步驟，但同樣第二天才獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果；鼠耳煮沸法縮短了實(shí)驗(yàn)周期，當(dāng)天即可篩選鑒定。

3.3 降低實(shí)驗(yàn)成本，避免操作風(fēng)險(xiǎn)

苯酚抽提法使用試劑較多且酚類物質(zhì)有高度腐蝕性, 易引起嚴(yán)重的燒傷[12]。鼠耳煮沸法只需2種普通試劑且價(jià)錢便宜，避免了乙醇等有機(jī)溶劑或濃縮鹽的介入，實(shí)驗(yàn)成本較低且無操作風(fēng)險(xiǎn)。

綜合比較，鼠耳煮沸法在批量篩選、快速鑒定模式小鼠基因型鑒定工作更為實(shí)用。

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